SRY基因、SOX-9基因檢測在性反轉中的應用研究

鄧國良 常大黎 朱崢燕 黃俊生

河南濮陽市婦幼保健院檢驗科（457000）

1990年，Sinclair等[1]在對XX男性性反轉患者的研究中，首先發現了SRY基因，表明它在性腺發育中的作用，但是近年來發現有不少患者SRY基因陰性而表現為男性性反轉。SRY基因編碼的蛋白質有與DNA結合的模體，稱為HMG盒，在HMG盒內與SRY產物具有60%以上的氨基酸序列相似性的編碼基因命名為SOX（SRY Related HMG box genes）基因，其中SOX-9基因在軟骨組織和性腺中表達，從而引起了人們對SOX-9的重視。SOX-9基因的突變或重復會導致軀干、性腺的發育異常。

1 對象與方法

1.1 對象

1995年以來在濮陽市婦幼保健院生殖中心就診的患者，他們大多是以不孕不育來診，共發現性反轉患者5例，46，XX男性性反轉4例，46，XY.t（10；13）（p10；q22）女性性反轉1例其中1例46，XX男性性反轉SRY基因陰性，SOX-9基因陽性，社會性別男性，陰莖短小，陰毛女性分布，尿道下裂，雙側乳房發育良好，形態似女性，激素檢測為：雌二醇、孕酮正常，睪酮偏低、促卵泡生成素偏高。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析

患者外周血2mL，肝素鋰抗凝，18～24滴于 1640培養液中37℃培養68h，收獲前1h15min加入秋水仙素，常規G顯帶分析，必要時加作C帶，計數30個分裂相，核型分析系統分析3～5個核型。

1.2.2 選不同顏色的X染色體探針和SRY基因探針，雜交，共變性后，37℃過夜，洗滌，復染熒光顯微鏡下觀察，從FISH結果看3例均檢測到SRY基因，其中1例46，XX和1例46XY女性性反轉未檢出SRY基因，4例SRY基因均易位到X染色體上，4例46，XX性反轉均未見Y染色體。

1.2.3 SOX-9基因的檢測

采取患者2mL外周血TDTAK2抗凝，試劑：TapDNA聚合酶，SOX-9引物序列，SOX-9外顯子引物F：5′-CAGGAGGGAAGATGG AGTTG-3′；R：5′-GCATAAAGTCCCCACGAAGA-3′片段長度為491bp，各管體積為50μL內有dNTP200μmol/L，擴增引物10pmol等，擴增條件為94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共循環30次，取擴增物10μL加2μL溴酚藍混勻，電泳結果如圖1。

圖1 SOX-9基因電泳圖

1.2.4 對其中的一例患者46，XX男性性反轉SRY基因陰性，而SOX-9基因陽性進行了基因測序，與正常對照，并未發現異常。

2 討 論

2.1 性反轉綜合征（sex reverse syndrcme）是染色體核型和性腺性別不一致的一類疾病，它包括46，XX男性性反轉和46，XY女性性反轉。46，XX男性綜合征是一種少見的性反轉疾病，男性新生兒發病率約為1∶20 000。患者表型多為男性，從這5例患者的外觀，外生殖器及染色體核型分析看這5例均屬于性反轉，其中3例46，XX男性性反轉，是由于SRY基因易位到X上所致，1例46，XY.t（10；13）（p10；q22）女性反轉是缺失SRY基因所致。文獻報道，在能夠檢測到的XX男性中，大約80%的病因可與父親減數分裂過程中X和Y同源區域之間的不等交換有關，使帶有SRY基因的 Y染色體片段易位到 X染色體短臂上，也有報道SRY基因易位到常染色體上。睪丸決定因子（Yp11.3 SRY testicular detemining factor，TDF的最佳候選基因定位于染色體上Y的基因，睪丸在原始性腺中的發育就是由它促使的，男性個體的表型由睪丸產生的激素決定，不管受精卵中有沒有Y染色體只要缺乏SRY基因，胚胎的原始性腺就會向卵巢分化即胎兒發育成女性。SRY基因發生易位缺失或者突變都可能導致性腺發育異常，SRY基因具有表達的時間特異性和組織特異性，只在睪丸組織中表達。研究表明，SRY基因對男性性別起著開關控制的作用，這種開關控制是通過對其他基因表達的調節而形成的。

2.2 有很少一部分患者，在沒有SRY基因的情況下，性腺也能發育，這就使人們想起SOX基因，SOX基因是SRY基因的 HMG編碼區有較高的同源性的人類基因組中有幾個保守的 SRY樣基因 SRY-like gene，SOX-9基因是 SOX基因家族中一員，位于 17號染色體長臂，有報道即使沒有 SRY基因，而有重復的 SOX-9或者SOX-9發生突變，從而使其表達增強也能導致睪丸分化，從而表現46，XX男性SRY陰性。但與SRY基因僅在哺乳動物發現不同，SOX-9在脊椎動物均可發現，似乎表明SOX-9是比SRY更古老的性別分化基因。Huang等[2]于1999年報道1例SRY基因陰性的46，XX，dup（17）（q23.1q24.3）/46，XX男性性反轉患者，FISH證明在17號染色體上SOX-9基因出現重復拷貝說明在缺乏SRY的情況下，額外拷貝的SOX-9基因足以啟動睪丸分化，本文所述病例基因測序并未發現突變很可能是SOX-9基因的重復所致。最近，Malki 等發現，前列腺素D（prostaglandin D，PGD）可誘導培養的正常大鼠雌性性腺表達SOX-9。由此可見，染色體異常及其他旁路激活（如PGD）介導的SOX-9基因表達上調可能導致SRY陰性的46，XX 男性發生。作為SRY 同源基因的SOX-9 基因，它的高表達與睪丸分化相關，SOX-9基因繼 SRY表達后第1個在支持細胞前體細胞表達的基因。動物實驗證實，在SRY基因不存在的時，SOX-9基因在未分化性腺的雌性小鼠中過度表達，就能引發Muller 管抑制物質Mis表達，使雄性生殖器官正常發育，性腺發育為睪丸。SOX-9在雌性性腺的異常表達與人類和動物的性反轉相關。這表明有功能的Sertoli 細胞可以有過度表達的SOX-9基因支持細胞的前體細胞分化。做為 SRY分化的第1個分子標志物，Mis可促使移入未分化性腺中的Leydig 細胞前體細胞在Sertoli 細胞分泌因子作用下分化為Leydig細胞，分泌睪酮，促進雄性生殖管道正常發育。由此認為在SRY基因缺失的情況下SOX-9 可發揮作用。研究表明，對性別決定有影響的除SRY基因之外，X染色體或常染色體上的某些基因發生改變也可導致睪丸發育。也有研究表明，在正常男性的某個常染色體基因表達被SRY基因所抑制因而發育為男性，而正常女性發育時沒有SRY抑制常染色體基因表達因而發育為女性，這一常染色體基因的表達失活也可造成無SRY XX的男性個體的發生。因此，性別決定是除SRY基因之外多基因參與的復雜過程。胚胎期正常性分化的結果實際上是看睪丸的分化，它的分化與否決定性別發育的方向。人類胚胎的正常性分化，包括確定3個性別：①性腺性別；②表型性別；③染色體性別。人類3種性別的劃分與決定是以分子遺傳學和細胞生物學為基礎的極為復雜，彼此獨立又密切相關的演變過程。每一次獨立的性別分化階段按嚴格規律循序漸進同時又受各階段特異的因子的控制。第一階段是染色體或遺傳性別的確定，這個階段有精卵結合所決定，第二階段是在各種影響因子的影響下由染色體性別轉變為性腺性別。第三階段是表性性別的發育完成由外生殖器官和生殖管道完成而決定。在正常發育情況下，性腺性別、染色體性別和表型性別是一致的，在性分化的任何階段中出現異常，上述3種情況均可出現不一致現象，從而引起多種程度不同的性分化異常疾病。人類3～5周胚胎的性腺還沒有分化，具有分化卵巢和睪丸的兩種潛力，約于精卵結合后第6周，在SRY基因和Y染色體的影響下，原始性腺分化為睪丸；而無SRY基因和Y染色體的 XX胚胎，原始性腺將于第13周自然發育成卵巢。Y染色體及SRY基因的存在決定了睪丸的發生，從而決定了性別的分化。而SRY基因與睪丸的發生密切相關。SRY基因編碼一種含 204個氨基酸的核蛋白 SRY蛋白，它定位與Yp11. 32，在早期胚胎發育的性腺組織中有短暫表達，導致原始性腺組織向睪丸組織分化。SRY基因 HMG盒，能特異性地識別和結合核心序列為 5′- CCTTTGA - 3′的DNA片段，從而對其受控基因的編碼進行調控。很明顯，其間若發生堿基置換、基因突變、易位或缺失均可導致SRY蛋白失活，從而表現為46，XY女性性反轉。由此可知，鑒定SRY基因存在與否為早期診斷性分化異常提供了依據。還有其他一些基因如 WT1、SOX-9、SF1、M IS、SIPs、XH2、DAX - 1、Wat家族等也與睪丸決定性別分化有關。

2.3 遺傳模式與產前診斷

46，XX男性性反轉90%與SRY 基因陽性有關的，并且常發生在X染色體上，若其 SRY 易位到常染色體，母親表型正常不攜帶致病基因而其父親表型正常但可能攜帶易感基因。若先證者SRY易位到X染色體，則其雙親表型正常也不攜帶致病基因；而其男性同胞中XY型者不受累而 XX型者受累概率＜1%；其中若父親基因型為XY且有2套SRY分別易位到X染色體和常染色體，則先證者男性同胞中XY型個體不受累而XX型者將同時受累，出現46，XX真兩性畸形或46，XX性反轉。若 SRY易位到常染色體，則不增加先證者同胞受累概率；若同時先證者父親的SRY基因也易位到常染色體，則XX基因型同胞中有50%可能SRY基因易位，出現46，XX真兩性畸形或46，XX性反轉。Abbas報道SRY易位到常染色體，生育能力不受影響，若SRY基因陽性的46，XX男性的SRY易位到X染色體，則無生育能力。對于SRY基因陰性的遺傳還不清楚，可能是常染色體隱形遺傳，其母親或父親必為正常的雜合子。其同胞1/2為攜帶致病基因，1/4可能受累，1/4完全正常，雜合子無異常癥狀[3]。產前診斷：當超聲診斷和染色體核型分析不一致時，應當給與重視，看是否是性反轉。避免性反轉患兒的出生。從發生性反轉的比例來看，性反轉已經不是一個小數，但是得到早期診斷和治療的，從報道看不過幾百例，得到產前診斷的只有2例，我相信隨著染色體 Giemsa染色顯帶技術的改進、聚合酶鏈反應PCR 技術和熒光原位雜交 FISH技術的廣泛應用，及其人們產前診斷意識的增強，我們是可以做到早診斷、早治療的。

2.4 治療

早期發現社會性別和核型分析不一致是治療的關鍵，嬌治外生殖器官并給與激素治療是診治性反轉患者的主要原則。對于SRY陽性的46，XX男性的患者，盡管其缺乏生精能力且外生殖器發育不良，但是間質細胞仍具有一定的內分泌功能，能形成男性的一些特征，及時檢測內分泌，必要時在青春期給予雄性激素的治療，以促進男性性征的發育，成年后可有性沖動和性生活，因此沒有必要轉換性別，重點在矯正外生殖器官的畸形，成年后盡管不能生育，給與激素治療，以維持足夠的性欲，提高生活質量。對于SRY陰性的46，XX男性患者多表現為性別難辨，治療處理常須根據患者性心理及生理發育狀況謹慎考慮，依靠激素維持第二性征可能無法避免。總之，性腺分化是多基因參與的過程，任何過程的變化均可有一定程度的表現改變，隨著人們對性反轉發病機理研究的不斷深入，終將揭開它的面紗。

[1]Sinclair AH,Berta P,PalmerMS,et al.A gene from the human sexdetermining region cncodes aprotei with hemology to a conserved DNA-bingingmotif[J].Nature,1990,346(6281)：240-2442.

[2]HuangB,Wang S,Ning Y,et al.Autosomal XY sex rexersal caused by dup lication of SOX-9[J].Am J Med Genet,1999,87(4)：349-3533.

[3]柳林,逄力男,楊利麗.46,XX男性表型及遺傳學研究進展[J].國外醫學內分泌學分冊,2005,25(4)：283-285.