YX27菌株篩分及去除富營養化河水中氨氮的研究

魏麗娜，商 平，王 偉

（1.天津科技大學 海洋科學與工程學院，天津 300457；2.天津市節水事務管理中心，天津 300074）

隨著社會經濟的迅速發展和人口資源的日益膨脹，水環境污染已經成為一個迫在眉睫的問題，氨氮含量是污水水質的一項重要指標，也是引起水體富營養化的主要因素之一．因此，廢水的生物脫氨研究越來越受到重視[1]．國內外對于脫氨技術的研究無論是在傳統工藝中還是在新開發的工藝中，篩選降解氨氮的亞硝酸菌株一直以來都是研究熱點與重點，也是決定反應速度的重要一步[2-4]．

關于亞硝酸菌的分離和富集培養技術，國內外已有相應的研究[5-6]，但這些方法、過程較為復雜，或者培養時間較長，且用于富營養化河水治理的較少．本次實驗在前人研究的基礎上，簡化篩分過程，縮短培養時間，進行純種亞硝酸菌分離篩選和初步鑒定，并最終將其應用于天津富營養化河水中氨氮的降解，具有實際意義．本文從曝氣池活性污泥中經5次富集培養、2次分離純化和效果測定篩選出1株降解氨氮能力較好的菌株，并通過個體形態特征、菌落特征觀測和生理生化實驗對其進行初步鑒定．通過多次馴化，將此菌應用于出現富營養化的河水中，并確定此株菌去除氨氮的最佳條件．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源與實驗用水

菌種從天津泰達污水處理廠（曝氣池中）的活性污泥中分離獲得；使用濃度為100 mg/L的模擬氨氮廢水進行菌株復篩．氨氮去除效果測定，使用天津外環河河水，水質指標為SS:97～135mg/L，NH3-N:6.57～21.23 mg/L，TP:0.33～1.68 mg/L，COD:168.18～316.7 mg/L，pH:7.2．

1.1.2 培養基

亞硝酸細菌選擇培養基主要成分為：(NH4)2SO40.2 g；K2HPO43H2O 0.13 g；MgSO47H2O 0.03 g；NaCl 0.12 g；FeSO47H2O0.02g；CaCO3(MgCO3)0.1g；NaHCO30.2g；H2O100mL；pH 7.5～8.0．培養基在121℃滅菌20 min．

亞硝酸細菌分離瓊脂培養基主要成分為：(NH4)2SO40.05 g；K2HPO43H2O 0.13 g；MgSO47H2O 0.03 g；NaCl 0.12 g；FeSO47H2O 0.02 g；CaCO3(MgCO3)0.1 g；NaHCO30.2 g；H2O 100 mL；pH 7.5～8.0．培養基在121℃滅菌20 min．固體分離培養基補加 (1.5%～2%)的瓊脂．

亞硝酸細菌分離硅膠培養基制作方法：根據文獻 [7]制作硅膠平板，取155mL蒸餾水加5.5mL比重為1.84的濃硫酸，取185 mL蒸餾水加22.0 mL比重為1.19的濃鹽酸，兩者混合即為稀酸液，稱82.6 g硅酸鈉(Na2SiO39H2O)，加500mL蒸餾水，攪拌溶解即為水玻璃，分別吸取15mL水玻璃和10mL稀酸液于小燒杯中，快速攪拌混勻，倒入培養皿中，靜置凝固．將凝固后的硅膠板洗至無Cl，倒置過夜晾干．在每一硅膠板表層加入亞硝酸菌分離培養液2 mL后放入烘箱35～45℃維持1.0～1.5 h至表層無營養液流動，然后與培養皿蓋子一同在紫外燈下照射30min即成為分離亞硝酸細菌的硅膠培養基．將其應用于培養亞硝酸細菌時采用“桶水袋罩法”，保證了培養條件的穩定性，且平板基本不裂，菌落的培養與觀察均不受影響．

本次實驗采用肉膏蛋白胨培養基、麥芽汁培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基作為雜菌檢驗培養基[8]．

1.1.3 混合試劑[8-9]

本次實驗采用格利斯試劑，革蘭氏染色試劑，生理生化特征鑒定試劑和納氏試劑．

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種富集培養

取10 mL所采集的泥樣加入到事先已滅菌、內裝200 mL亞硝酸細菌選擇培養基的三角瓶中 (內置玻璃珠)，30℃搖床、160 r/min培養10 d．再從中取樣10 mL接入內裝200 mL亞硝酸細菌富集培養基的三角瓶中，30℃搖床、160 r/min繼續培養10 d，如此富集5次，有利于所篩菌株的富集．

1.2.2 菌種分離純化與雜菌檢驗

從富集培養菌懸液中取出1 mL菌懸液接入裝有9 mL無菌水的試管內，依次得到101、102、103、104、108梯度的菌懸液，分別取0.1 mL菌懸液于亞硝酸菌分離硅膠培養基，用涂布器均勻涂布，待培養基凝固后倒置平皿，放入30℃培養7～14 d．挑取單菌落于亞硝酸菌分離瓊脂培養基進行平板劃線分離，30℃培養7～14 d，進行單菌分離．將得到的單菌株轉接到斜面上，做好標記．各菌株采用牛肉膏蛋白胨培養基檢查異養型細菌、麥芽汁培養基檢查酵母菌、馬鈴薯葡萄糖培養基檢查霉菌．若分離純化所得菌株分別接種于上述3種有機營養培養基平板上，均不生長，則移入斜面保藏備用．否則，需要進一步進行分離、純化．

1.2.3 菌株篩選

1.2.3.1 氨氮降解菌的初篩

將亞硝酸細菌選擇培養液分裝于試管中，每管10mL，滅菌后，將分離純化得到的菌株各接一環于該液體培養基中．另取1管培養基接種1.0 mL無菌水作為對照．30℃培養7～14 d后，取培養液于白瓷比色板上，加格利斯試劑Ⅰ液和Ⅱ液各1滴，若有亞硝酸鹽存在，則呈紅色，證明有亞硝化作用[10]．將有亞硝化作用的菌株保存，備用．

1.2.3.2 氨氮降解菌的復篩

將初篩得到的菌株接種到氨氮濃度為100mg/L的模擬氨氮廢水中，30℃、160 r/min搖床培養7d，然后經2 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL，稀釋100倍，以空白培養液作對照，測定培養液中氨氮濃度的變化，根據標準曲線換算含量．

1.2.4 氨氮的測定方法

通過納氏試劑分光光度法[9]對水中氨氮進行測定．

1.2.5 YX27菌株的形態和生理生化實驗

YX27菌株的個體形態特征及菌落形態特征觀察所用的菌株均為瓊脂培養基培養7 d的菌株．

YX27菌株形態特征的形態觀察：首先是用肉眼進行最基本的群落觀察，然后通過染色在顯微鏡下對其形狀、大小及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態結構上的特性，根據不同微生物在形態結構上的不同，達到區別、鑒定微生物的目的．由于各種細菌的新陳代謝類型不同，對不同物質利用后所產生的代謝產物有差異，所以采用生理生化反應來鑒別YX27菌株在形態和其他方面不易區別的微生物．

菌體濃度的測定：1）將YX27接種到亞硝酸細菌液體培養基中，在30℃、160r/min的搖床上振蕩培養，每隔1d取樣在600nm波長下測定其OD值，并做此菌株的生長曲線．2）通過MPN-Griess法對YX27進行計數檢測[11]．用平板法計數亞硝酸細菌比較繁瑣、菌落小、培養時間長，雜菌也會同時生長，而且亞硝酸細菌的單菌落很難同雜菌菌落相區別．因此，本實驗對于 YX27菌株采用最大可能數法 (most probable number，MPN)計數．取1 mL YX27菌懸液進行10倍梯度稀釋，取101、102、 1088個稀釋度，將上面各稀釋度樣品分別取l mL接種到含9mL亞硝酸細菌計數培養基的試管中，每一稀釋度各接種4管，30℃培養7d，格利斯試劑使之顯色．

1.2.6 YX27去除天津外環河河水中氨氮的條件優化

將篩選出的菌株YX27經與實驗用水指標相似的培養液進行逐步培養，通過馴化使其適應環境，應用于天津外環河河水中氨氮的去除，考察pH值、溫度、時間和搖床轉速等條件對氨氮去除率的影響．

2 結果分析

2.1 氨氮降解菌的分離和篩選

經過富集培養和分離純化共得到48株菌株，經過格利斯試劑驗證顯色的有32株菌，顯色越深表明亞硝化作用越強．菌株在此過程中顯色并不能說明這些菌株就是亞硝酸菌，還需要通過測定這些菌株的氨氮去除率來進一步判斷是否有亞硝化作用．用初始NH3-N濃度為100 mg/L的模擬廢水對這些菌株進行氨氮去除率（即亞硝化能力）的搖瓶實驗，測定指標為氨氮濃度，以不接菌種的培養液作為空白對照，30℃、160r/min，培養7d后觀察各菌株的氨氮去除率，去除率達70%的菌株有YX45、YX15、YX27，其中菌株YX27對氨氮去除率最高，達80.18%．因此，本次實驗選用氨氮去除效果最好的YX27為實驗菌株．

2.2 YX27菌株的初步鑒定

由YX27菌株的個體形態特征（圖1）、菌落特征和生理生化實驗（表1）可知：YX27是不需要有機生長因子，嚴格好氧的專性化能自養細菌，參考《常見細菌系統鑒定手冊》[12]和《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版）[13]，初步鑒定YX27屬于亞硝化球菌屬()．

2.3 YX27菌株的生長情況

2.3.1 YX27菌株的生長曲線

在亞硝酸細菌選擇培養基中接入YX27菌株，在溫度30℃、160 r/min下振蕩培養，每天取樣在波長600nm處測定其OD值，繪制生長曲線，結果如圖2所示．由于此類菌是化能自養菌，生長比較緩慢，世代周期長，2 d后進入對數生長期；在第7 d菌體濃度達到最高，再延長培養時間出現衰亡趨勢．

2.3.2 YX27菌株的MPN-Griess計數檢測結果

根據出現的陽性管數得到MPN數量指標421，查MPN表得細菌近似值為9.5，數量指標第1位數字4對應的稀釋度為105，則亞硝酸細菌密度為9.5×106mL1．

2.4 YX27菌株在富營養化河水氨氮去除中的應用

2.4.1 pH值對氨氮去除率的影響

圖1 YX27菌株革蘭氏染色Fig.1 Gram staining of YX27

圖2 YX27菌株生長曲線Fig.2 Growth curveof YX27

圖3 pH值對氨氮去除率的影響Fig.3 Effectof pHvalueon NH3-Nremoval rate

從制成的YX27菌株種子培養液中分別用接種環接一環于100mL pH值分別調至6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4的河水中，在溫度30℃、搖床160 r/min下處理，7 d后測定氨氮濃度，考察pH值對廢水中氨氮去除效果的影響，結果見圖3．

pH值是影響廢水生物脫氨一個重要因素，從圖3可以看出隨著pH值的升高YX27菌株對氨氮的去除率均呈上升趨勢，pH值在7.2～7.6時氨氮去除率增加趨勢逐漸緩慢，且去除率均在72.00%以上，最高去除率達到76.56%．因為硝化需要消耗廢水中的堿，因此pH值較低時細菌的降解作用比較微弱，去除率比較小，考慮到初始時細菌的生長和硝化過程所需，處理廢水時pH值控制在7.2～7.6之間為宜．

表1 YX27菌株個體形態、菌落、生理生化特征Tab.1 Features of individual morphology colony physiological of YX27

2.4.2 溫度對氨氮去除率的影響

從制成的YX27菌株種子培養液中分別用接種環接一環于pH值為7.4的7瓶100 mL河水中，分別置于溫度20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃下160 r/min振蕩處理，7 d后測定氨氮濃度，考察處理溫度對氨氮去除效果的影響，結果見圖4．

溫度是影響細菌生長和代謝的重要因素，也是影響生物脫氨的重要原因，從圖4可以看出，隨著反應溫度的升高，去除率不斷增大，在30℃時去除率最大，去除率最高時達到80.24%，若溫度再高則可能會破壞細菌的酶系造成去除率下降，因此適宜溫度在30℃左右．

2.4.3 振蕩速度對氨氮去除率的影響

亞硝酸細菌正常代謝需要溶解氧，大多數學者認為溶解氧應控制在1.5～2.0 mg/L為宜[3]．通過改變搖床轉速可以考察溶解氧濃度的變化對亞硝酸細菌的處理效果．從制成的 YX27菌株種子培養液中分別用接種環接一環于pH值7.4的6瓶100 mL河水中，溫度為30℃，轉速分別為50 r/min、100 r/min、120 r/min、140r/min、160r/min、180r/min，振蕩處理7d后測定氨氮濃度，考察處理的振蕩速度對氨氮去除效果的影響，結果見圖5．

圖4 溫度對氨氮去除率的影響Fig.4 Effect of temperatureon NH3-N removal rate

如圖5所示，隨著振蕩速度的加快，溶解氧濃度增加，去除率不斷增大，在振蕩速度為180 r/min時去除率最大，去除率最高時達到79.06%．

2.4.4 處理時間對氨氮去除率的影響

從制成的YX27菌株種子培養液中用接種環接一環于pH值7.4的100 mL河水中，在溫度30℃、180 r/min下培養，每天取樣測一次氨氮濃度，連續測定10d，考察處理時間對氨氮去除效果的影響，結果見圖6．

從圖6可以看出，隨時間的變化，YX27菌株在1～2 d對氨氮的去除率均較低，從3～7 d隨時間的推移對氨氮的去除率穩定增加，去除率最高時達到86.12%，7 d后增加速度平緩或有下降趨勢，基本達到穩定．由圖2細菌生長曲線可知，在第7d細菌數量最多，菌體濃度最高，此時廢水中細菌可攝取的營養物質已經很少，繼續反應氨氮去除率無明顯提高，因此YX27菌株最佳反應時間為7～8 d．

3 結論

1）本實驗采用兩種分離培養基對YX27菌株進行分離純化：硅膠平板選擇性強，用于分離亞硝酸細菌；而瓊脂平板容易培養，生長時間較短，用于純化亞硝酸細菌．有效提高了亞硝酸細菌的分離純化效率，方便實用．

2）采用MPN-Griess計數檢測對YX27菌株進行計數，克服了用平板法計數亞硝酸細菌較繁瑣、菌落小、培養時間長，雜菌同時生長且難同雜菌菌落相區別等缺點．

3）通過YX27菌株個體形態特征、菌落特征觀測和生理生化實驗，初步鑒定YX27菌株屬于亞硝酸球菌屬

4）通過馴化的YX27菌株應用于富營養化河水中氨氮的去除，實驗結果表明：在pH值7.2～7.6、振蕩速度180r/min、溫度30℃時，YX27菌株對富營養化河水中氨氮的去除效果較好，去除率最高可達到86.12%，處理時間7～8 d．

圖5 振蕩速度對氨氮去除率的影響Fig 5 Effect of vibrating rateon NH3-N removal rate

圖6 時間對氨氮去除率的影響Fig.6 Effect of timeon NH3-N removal rate

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