TSLC1和4.1B在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

王振華 楊鯤鵬 王旭廣 張進 郝德勛 陳占軍

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%左右，肺癌的發生是多步驟、多階段、多基因相互作用的結果，涉及多種癌基因的激活與抑癌基因的失活，其中抑癌基因的失活在近幾年的研究中越來越受到重視[1]。肺癌腫瘤抑制物1（tumor suppressor in lung cancer-1, TSLC1）是Murakami[2]通過功能互補方法發現的一個腫瘤抑癌基因，該基因的突變與失活與人類多種腫瘤密切相關。肺腺癌差異表達基因（differentially expressed in adenocarcinoma of the lung, 4.1B）蛋白主要定位于細胞-細胞聯結處，呈蜂窩狀分布。研究[3]表明在腦膜瘤、乳腺癌、腎透明細胞癌和結腸癌等腫瘤組織中4.1B無論是RNA還是蛋白均出現表達下調或缺失現象。目前對上述兩種基因的研究多集中于蛋白水平，且兩者在NSCLC中表達的相關性國內報道尚少。本研究應用RT-PCR的方法從基因水平上檢測TSLC1、4.1B在NSCLC中的表達，并分析兩者的相關性及其與患者臨床病理特征的關系，旨在為NSCLC的臨床診斷、預測轉移和分子治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 一般資料 所有標本均來自2009年12月-2010年4月間鄭州大學第二附屬醫院胸外科手術切除并經病理證實為NSCLC的新鮮腫瘤組織52例及相應癌旁正常組織52例。其中男性33例，女性19例；年齡35歲-73歲，平均（55.12±8.61）歲；組織分型：鱗癌29例，腺癌23例；分化程度：高分化17例，中分化23例，低分化12例；TNM分期：I期15例，II期24例，III期13例。所有病例術前均未進行放療、化療及其它針對腫瘤的生物學治療。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及RT-PCR擴增 取新鮮冰凍組織約100 mg加入Trizol 1 mL（按說明書操作）逐步提取總RNA，應用紫外分光光度計測定并計算所提RNA濃度。cDNA（complementry DNA）第一鏈合成體系為20 μL，取總RNA 8 μL、EasyScriptRT/RI Enzyme Mix 1 μL、Anchored Oligo(dT)10 μL、2×ES Reaction Mix 1 μL，輕輕混勻，42oC孵育30 min，85oC加熱5 min。取2 μL進行后續擴增，其余-80oC保存。基因TSLC1、4.1B及內參（β-actin）擴增應用Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設計引物（表1），交北京賽百盛生物技術有限公司合成。PCR擴增反應體系：模板cDNA 2 μL、10×Easy Taq Buffer 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、Easy Taq DNA Polymerase 1 μL、上、下游引物各1 μL加水至50 μL。PCR擴增循環條件：94oC預變性2 min，1個循環；94oC變性30 s，XoC退火30 s，72oC延伸2 min，共35個循環；72oC總延伸6 min。最后4oC保存。

1.2.2 PCR產物結果判斷及半定量分析 取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統進行分析，目的基因mRNA的表達量以目的基因的DNA條帶和β-actin的DNA條帶灰度值比值計算。

1.3 統計學處理 所有數據用SPSS 11.5統計軟件處理，數據均以Mean±SD表示，兩組定量資料比較采用t檢驗，不滿足t檢驗條件的采用t′檢驗。多組定量資料比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用LSD-t檢驗。指標間相關性用Pearson相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA在NSCLC組織及相應癌旁正常組織中的表達 凝膠電泳顯示，TSLC1 mRNA（1 367 bp）條帶清晰無雜帶擴增，目的基因片段產物與設計引物條帶產物大小吻合，癌旁正常組織中條帶亮度明顯高于癌組織（圖1A）。4.1B mRNA（145 bp）條帶清晰無雜帶擴增，目的基因片段產物與設計引物條帶產物大小吻合，癌旁正常組織中條帶亮度明顯高于癌組織中條帶亮度（圖1B）。癌旁正常組織中TSLC1 mRNA與4.1B mRNA的相對表達量高于癌組織，差異有統計學意義（P＜0.01）（表2）。

2.2 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA的表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系 52例NSCLC組織中TSLC1 mRNA與4.1B mRNA的表達量在高、中分化組及TNM分期早期明顯高于低分化組及TNM分期晚期，差異有統計學意義（P＜0.05），而與性別、年齡、組織分型無關（P＞0.05）（表3）。

表1 TSLC1、4.1B和內參β-actin引物列表Tab 1 TSLC1、4.1B and β-actin primers list

圖1 TSLC1 mRNA（A）和4.1B mRNA（B）PCR擴增產物凝膠電泳圖。N為癌旁正常組織；T為癌組織；M為Mark。Fig 1 Gel electrophoresis of PCR amplification products for TSLC1 mRNA (A) and 4.1B mRNA (B). N are from tumor adjacent tissues; T are from tumor tissues; M are from Mark.

表2 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA在NSCLC組織及相應癌旁正常組織中的表達Tab 2 The expressions of TSLC1 mRNA and 4.1B mRNA in NSCLC and corresponding adjacent normal tissue

2.3 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA在NSCLC組織中表達的相關性 Pearson相關性分析顯示：肺癌組織中TSLC1 mRNA表達與4.1B mRNA表達之間呈正相關（r=0.471,P＜0.001）（圖2）。

圖2 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA在癌組織中表達水平的散點圖Fig 2 Scatter distribution of relative expressions of TSLC1 mRNA and 4.1B mRNA

3 討論

TSLC1全長大約300 kb，定位于人類染色體11q23.2上，含10個外顯子。翻譯產物為含有442個氨基酸殘基的跨膜糖蛋白。TSLC1屬于細胞粘附分子中免疫球蛋白超家族成員編碼細胞粘附分子（cell adhesion molecule,CAM），該分子是參與細胞與細胞之間相互作用的一種膜蛋白，除外周血淋巴細胞外人體絕大部分正常組織均表達TSLC1分子，它通過介導同種或異種細胞之間的相互粘附，在抑制惡性腫瘤的發生中起重要作用[4]。目前的研究[5-7]發現TSLC1的表達缺失或減少參與多種腫瘤的發生發展，包括乳腺癌、食管癌和宮頸癌。臨床病理學研究分析顯示TSLC1的失活在腫瘤晚期發生更頻繁。Yang等[8]用免疫組化法發現TSLC1的表達與腫瘤分期、淋巴結受累、淋巴管滲透以及血管入侵呈負相關。因此我們推測TSLC1可能與腫瘤的生物學行為，包括侵襲和轉移有關。本研究顯示：TSLC1的表達與NSCLC的分化程度、TNM分期有關（P＜0.05），而與患者的性別、年齡以及病理分型無關（P＞0.05），研究結果與國外現有文獻[9]報道一致，說明TSLC1可能影響NSCLC的發生、發展和轉移，TSLC1可以作為判斷NSCLC惡性程度的一個重要的生物學指標。

4.1 B屬于4.1超家族蛋白，定位于人類染色體的18p11.3區域，4.1蛋白通過與肌動蛋白、血影蛋白等家族的蛋白質以及細胞膜蛋白的胞質區相互作用，維持細胞的正常形態和生理特性[10]。據Ohno等[11]報道4.1B在消化系統中可能不僅有維持其正常結構構建的作用而且有維持正常細胞增殖和粘附的作用，因此可抑制上皮細胞的惡性轉化。Tran等[12]發現與癌旁肺組織相比，肺腺癌中4.1B mRNA表達水平明顯降低，在所檢測的10株細胞中有8株細胞4.1B mRNA表達缺失。本研究顯示：與癌旁正常組織相比，4.1B蛋白在肺腺癌和肺鱗癌中的表達明顯減少，并且還顯示4.1B表達與NSCLC分化程度、TNM分期有關（P＜0.05），而與患者的性別、年齡以及病理分型無關（P＞0.05），說明4.1B可能影響NSCLC的發生、發展和轉移，進一步證實了4.1B是一種廣泛存在的抑癌基因。

表3 TSLC1 mRNA與4.1B mRNA的表達與NSCLC患者臨床特征的關系Tab 3 The relationship between the expressions of TSLC1 mRNA and 4.1B mRNA and the clinical features

Yageta等[13]研究認為TSLC1通過4.1B與肌動蛋白骨架相連接，兩種基因可能位于同一級聯路徑維持穩定的粘附結構。癌細胞中TSLC1或4.1B的缺失可能影響正常細胞粘附，導致腫瘤轉移到鄰近組織或末梢組織。TSLC1-4.1B級聯反應也影響原發性腦脊膜瘤的發生發展[14]，這些都說明TSLC1和4.1B之間存在密切聯系，我們用RT-PCR的方法研究了NSCLC中兩種基因的表達及其相互關系，結果表明TSLC1與4.1B在NSCLC組織中的表達量明顯低于相應癌旁正常肺組織（P＜0.01），TSLC1與4.1B在癌組織的表達呈正相關（r=0.471, P＜0.001）。

總之，TSLC1與4.1B在NSCLC組織表達下調或缺失均與NSCLC的分化程度及TNM分期有關，與患者的性別、年齡以及病理分型無關，并且二者具有相關性。TSLC1蛋白可能與4.1B蛋白共同參與NSCLC的發生、發展和轉移。但我們目前僅是對其基因水平的表達情況進行了研究，要想確定其作為抑癌基因的功能還需要對上述兩種基因是否具有生長抑制的功能及其作用的信號通路進行更深入的研究，從而進一步闡明TSLC1與4.1B在NSCLC發生發展過程中的作用機制，也將為NSCLC發病機制的研究提供新的依據，為NSCLC的臨床診斷提供新的標志物，并有可能為肺癌的治療提供新的靶點。