COX-2及其轉錄因子NFAT3和c-Fos在非小細胞肺癌中的表達及意義

趙曉鴻 陳照麗 趙守華 赫捷

環氧化酶2（cyclooxygenase 2, COX-2）是前列腺素合成過程中的關鍵酶，與腫瘤的發生發展具有密切的關系。在很多惡性腫瘤組織中均可檢測到COX-2的過表達[1-5]。研究表明一些細胞因子、生長因子、佛波酯、化學致癌物以及癌基因均能夠誘導COX-2的表達[6-9]。COX-2特異抑制劑能夠有效抑制腫瘤的生長[10]。COX-2的表達水平受多種機制的調節。NF-κB等多種轉錄因子能調節COX-2基因的轉錄活性[11]；也有研究[12]證實COX-2 mRNA的穩定性受TGF-β和Ras協同作用的調節。

活性T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells,NFAT）是細胞內普遍存在的一類轉錄因子家族。該家族包括5個成員，在多數情況下與活化蛋白質1（activator protein 1, AP-1）等其它轉錄因子結合成異二聚體，與特定的DNA序列結合，啟動下游基因的轉錄。NFAT在多種腫瘤細胞中調節細胞增殖、凋亡、轉移等活性。研究[13,14]表明，在結腸癌和乳腺癌細胞中NFAT和AP-1共同作用可以調節COX-2的轉錄。在T細胞、腎小球上皮、神經膠質細胞中NFAT也是COX-2的轉錄因子[15-17]。亞砷酸鹽引起支氣管上皮細胞惡變的過程中，NFAT通過激活COX-2的轉錄發揮了關鍵作用[18]。

已有的研究表明NFAT和COX-2在非小細胞肺癌中均過表達[19,20]，但NFAT與COX-2之間的關系未見報導。本課題組前期對NFAT家族的研究表明，NFAT1、NFAT2、NFAT4與COX-2的表達均無相關性（尚未發表）。為進一步探討肺癌中調節COX-2表達的轉錄因子，本研究在非小細胞肺癌組織中檢測COX-2及其可能的轉錄調節因子NFAT3、AP-1的亞基c-Fos蛋白和c-Jun蛋白的表達水平，分析其表達之間的關系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 回顧性收集1998年1月-2001年12月間在中國醫學科學院腫瘤醫院接受手術治療的原發性非小細胞肺癌病例159例，均未進行術前放療和化療。所有159例病例均具有詳細的臨床病理資料和5年隨訪資料。其中男性111例，女性48例；腺癌74例，鱗癌85例；高分化8例，中分化103例，低分化48例；I期70例，II期和III期89例。

1.2 試劑與方法 所有石蠟標本的HE染色切片均經病理醫生閱片確診，每例患者分別標記兩個肺癌組織點以及兩個距癌5 cm以遠的正常肺組織點，制備組織芯片。組織芯片上，每個組織點直徑1 mm，每個病例包括4個點。連續切片厚度4 μm。兔抗人COX-2多抗（RB-9072-P，工作濃度1:200）和兔抗人c-Fos多抗（RB-9431-P，工作濃度1:250）購自美國Thermo Fisher Scientific公司，兔抗人c-Jun多抗購自美國SAB公司（Ab-243, 1:200），兔抗人NFAT3的抗體購自英國Abcam公司（ab3447，工作濃度1:50）。PV9000及DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術有限公司。切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。微波爐中高火5 min、中低火15 min進行抗原熱修復，3%雙氧水、80%甲醇室溫30 min消除內源性過氧化酶活性。一抗4oC孵育過夜，PBS漂洗，PV9000室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復染，1%鹽酸、75%乙醇分化，1%氨水返藍，過梯度乙醇脫水，封片。PBS代替一抗為陰性對照。

1.3 免疫組化結果判斷 結果由中國醫學科學院腫瘤醫院兩位病理醫生分別獨立讀片。c-Fos和c-Jun核染色為陽性，COX-2漿染色為陽性，NFAT3核、漿染色均計為陽性。免疫組化結果均根據細胞染色強度評分0、1、2、3和4；根據陽性細胞的百分數評分0（≤5%）、1（6%-25%）、2（26%-50%）、3（51%-75%）、4（76%-100%）。計算芯片上每個組織點染色強度和陽性細胞數評分的乘積；根據得分判斷0為陰性，≤4分為弱陽性，＞4分為強陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。組間表達差異比較應用χ2檢驗，蛋白表達相關性分析用Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 COX-2、c-Fos、c-Jun、NFAT3在非小細胞肺癌中的表達情況 在159例非小細胞肺癌組織中，COX-2的陽性表達率為42.8%（68/159）（圖1）。在鱗癌中陽性表達率為52.9%（45/85），高于腺癌中的31.3%（23/74），差異具有統計學意義（χ2=7.723, P=0.005）。COX-2的表達與分化程度相關，高分化組的陽性表達率為87.5%（7/8），中分化組為42.7%（44/103），低分化組為35.4%（17/48），三組之間的差異具有統計學意義（χ2=7.600, P=0.022）。在男性中陽性表達率為47.7%（53/111），高于女性的31.3%（15/48），但差異無統計學意義（χ2=3.726, P=0.054）（表1）。COX-2表達在不同年齡、吸煙及病理分期的非小細胞肺癌患者之間無差異。而且COX-2的表達與患者的預后無相關性。在159例非小細胞肺癌組織中，c-Fos的陽性表達率為45.9%（73/159），在鱗癌中陽性表達率為52.9%（45/85），高于腺癌中的37.8%（28/74），但差異無統計學意義（χ2=3.634, P=0.057）。c-Fos的表達與患者的年齡、性別、吸煙、分化程度、淋巴結轉移和臨床分期均無明顯相關性（表1）。c-Jun的陽性表達率僅14.5%（23/159），其表達與臨床病理因素無相關性。NFAT3在28.3%（45/159）的肺癌組織中陽性表達，其表達與各種病理因素之間無相關性（表2）。

圖1 COX-2、c-Fos、c-Jun和NFAT3在非小細胞肺癌組織中的表達（IHC, ×200）。A：COX-2在非小細胞肺癌組織中陽性染色；B：c-Fos在非小細胞肺癌組織中陽性染色；C：c-Jun在非小細胞肺癌組織中陽性染色；D：NFAT3在非小細胞肺癌組織中陽性染色。Fig 1 Expressions of COX-2, c-Fos, c-Jun and NFAT3 in non-small cell lung cancer (IHC, ×200). A: positive staining of COX-2 in non-small cell lung cancer tissues; B: positive staining of c-Fos in non-small cell lung cancer tissues;C: positive staining of c-Jun in non-small cell lung cancer tissues; C: positive staining of NFAT3 in non-small cell lung cancer tissues.

表1 COX-2、c-Fos表達與非小細胞肺癌患者臨床病理因素之間的關系Tab 1 Association between expression of COX-2 and c-Fos and clinicopathologic characteristics of non-small cell lung cancer

2.2 COX-2與c-Fos、c-Jun、NFAT3表達的相關性（表3）在本研究的159例標本中，COX-2的表達與c-Fos的表達呈正相關（r=0.456, P＜0.001）。COX-2的表達與c-Jun的表達具有相關性（r=0.303, P＜0.001）。COX-2的表達與NFAT3的表達呈正相關（r=0.294, P＜0.001）。

2.3 NFAT3與c-Fos、c-Jun表達的相關性（表4） NFAT3與c-Fos的表達呈正相關（r=0.231, P=0.003）。NFAT3與c-Jun的表達呈正相關（r=0.428, P＜0.001）。

3 討論

COX-2是前列腺素合成過程中的關鍵酶，它的表達受到細胞內多條信號通路的調節。COX-2在多種腫瘤組織中表達上調，而且能夠調節腫瘤細胞的凋亡、侵襲能力，調節腫瘤血管形成和腫瘤微環境中炎癥因子的形成。多項研究證實，COX-2的表達與肺癌的發生相關。Hosomi等[21]研究表明，在71.6%肺不典型腺瘤樣增生組織中COX-2呈陽性表達。Mascaux等[22]研究也表明，在肺的重度不典型增生和原位癌組織中，COX-2的表達顯著高于正常組織和輕中度不典型增生。本研究結果表明，隨著分化程度的增高COX-2的表達水平增加。Wolff等[23]研究也發現COX-2在分化好的肺癌中的表達高于分化差的肺癌。另外，本研究檢測的159例非小細胞肺癌組織中，COX-2在鱗癌中的陽性表達率高于腺癌。已有的幾項研究[19,23,24]發現COX-2在腺癌中的陽性表達率偏高。在利用中國人肺癌組織標本的研究中，COX-2在肺鱗癌和腺癌中的表達無統計學差異[25]，這可能是樣本來源不同造成的差異。另外，COX-2的表達與非小細胞肺癌患者的預后無明顯相關[26]；在本研究中也未發現這種相關性，這表明COX-2主要參與肺癌的發生和早期階段。

表2 c-Jun 、NFAT3表達與非小細胞肺癌患者臨床病理因素之間的關系Tab 2 Association between expression of c-Jun and NFAT3 and clinicopathologic characteristics of non-small cell lung cancer

表3 非小細胞肺癌中COX-2和c-Fos、c-Jun、NFAT3表達強度的相關性Tab 3 Correlation between the expressions of COX-2 and c-Fos , c-Jun, NFAT3 in non-small cell lung cancer

表4 非小細胞肺癌中NFAT3與c-Fos、c-Jun表達強度的相關性Tab 4 Correlation between the expressions of NFAT3 and c-Fos or c-Jun in non-small cell lung cancer

NFAT能夠與轉錄因子AP-1相互作用激活基因的轉錄。在COX-2基因的啟動子區NFAT的結合位點與AP-1的結合位點相鄰，而且是COX-2轉錄激活必需的轉錄因子[15,27]。Wolfe等[28]解析出了NFAT與AP-1相互作用的晶體結構和關鍵氨基酸殘基。NFAT蛋白由3個結構域構成：NHR（NFAT同源結構域）、RHR（Rel同源結構域）和C端結構域。其中，RHR結構域的功能是與DNA結合、與其它轉錄因子相互作用。NFAT亞型之間RHR結構域高度同源，都能與相同的DNA序列結合[29]。不同的細胞中，調節COX-2轉錄的NFAT亞型不同。在乳腺癌細胞中，NFAT1和AP-1共同激活了COX-2的表達，增加了乳腺癌細胞的侵襲能力[14]。結腸癌細胞中NFAT2和AP-1共同作用激活了COX-2的轉錄，增強細胞的運動能力[13]。Huang等[18]研究表明，在正常肺支氣管上皮細胞中，致癌劑亞砷酸鹽引起的抗凋亡作用是通過激活NFAT3的轉錄活性而提高COX-2的表達水平來實現的。本研究的結果也表明，在非小細胞肺癌中，NFAT3的表達與COX-2的水平具有明顯相關性。本實驗室前期研究發現，雖然NFAT1和NFAT4陽性表達率高于NFAT3，但與COX-2的表達水平之間無相關性；可能通過調節其它基因的轉錄影響肺癌的發生發展。雖然NFAT2的表達與COX-2水平具有相關性，但NFAT2的陽性表達率很低，僅為11%，在肺癌中可能不發揮重要作用（待發表）。這些結果說明，非小細胞肺癌中不同的NFAT亞型可能發揮不同的作用，COX-2的表達主要受NFAT3的調節。

AP-1由Fos（c-Fos、Fos-B、Fra-1和Fra-2）和Jun（c-Jun、Jun-B和Jun-D）蛋白家族成員組成。Jun蛋白家族成員必須形成同源二聚體或與Fos蛋白家族成員形成異源二聚體組成轉錄因子AP-1。Fos家族成員不能形成同源二聚體，只能和Jun家族成員形成異源二聚體[30]。本研究結果表明，c-Fos在45.9%的非小細胞肺癌組織中陽性表達，而且其表達水平與COX-2和NFAT3表達水平都具有相關性。雖然在表達水平上c-Jun與COX-2和NFAT3都具有相關性，但在本研究159例肺癌組織中表達率只有14.5%。這提示，在非小細胞肺癌肺癌中c-Fos可能通過和Jun-B或Jun-D等蛋白結合組成AP-1，與NFAT3共同激活COX-2的轉錄，c-Jun可能在其中不起主要作用。COX-2在肺癌中表達的調節機制及其轉錄因子還有很多未知的領域，本研究的結果為深入進行這方面的研究提供了線索，有助于深入認識肺癌發生發展的分子改變。