CCR7上調MMP-9表達促進非小細胞肺癌轉移

李洋 劉巍 方莉 南娟 張占雀 周清華

趨化因子激素受體（CC chemokine receptor 7, CCR7）是CC家族趨化因子受體的成員之一，近來研究[1-3]發現，CCR7在多種腫瘤細胞中過表達，CCR7與其配體CCL21相互作用在腫瘤的特異性器官轉移中發揮重要作用，然而CCR7促進非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）轉移的機制卻不十分清楚。腫瘤的侵襲和轉移是一個十分復雜的過程，腫瘤細胞的侵襲一般要經歷細胞骨架改變、粘附性喪失、運動性的增強和表達溶解性蛋白酶等過程，此過程與基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9, MMP-9）有著密不可分的關系[4]。近來，有研究[5,6]發現CCR7可以上調結腸癌SW480細胞及慢性B細胞淋巴瘤細胞中MMP-9的表達。本實驗擬探討CCR7、MMP-9在NSCLC中的表達情況及相互關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 90例NSCLC組織臘塊來自中國醫科大學附屬第一醫院1980年1月-2005年12月間手術切除的肺癌組織，病史回顧無其它惡性腫瘤史。所有標本均經病理確診。所有標本均經10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，行4 μm連續切片，備用。

1.2 臨床病理資料 90例NSCLC包括：年齡≤50歲者50例，≥50歲者40例；鱗癌55例，腺癌35例；臨床病理分期顯示I期、II期共39例，III期、IV期共51例；淋巴結轉移54例，無淋巴結轉移36例。所有患者術前均未接受過任何的放療和化療，術后均經兩個療程的系統化療。

1.3 免疫組織化學染色 羊抗人CCR7多克隆抗體購自Santa Cruz公司，鼠抗人MMP-9單克隆抗體購自R&D公司；SP免疫組化試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發公司。染色方法按試劑盒說明書步驟進行，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組化結果判斷標準 結果判定在雙盲法下進行，每張切片由兩名病理醫師分別判斷。CCR7以胞漿和/或胞膜出現棕黃色顆粒視為陽性細胞；MMP-9以胞漿出現棕黃色顆粒視為陽性細胞。至少5個高倍視野下（×400）評價CCR7和MMP-9染色強度（1分=弱分，2分=強）和陽性腫瘤細胞百分比（0分=陰性，1%-50%=1分，51%-75%=2分，≥76%=3分）。上述兩項評分的乘積作為每個標本染色的最終評分，最后確定肺癌標本的染色情況分別為低表達（評分≤3分）或高表達（評分＞3分）。

1.5 細胞培養 本研究采用人大細胞肺癌細胞系BE1，細胞用含10%新鮮小牛血清的DMEM（Gibco, USA）、100 U/mL的青霉素、100 U/mL的鏈霉素的培養基，在37oC、5%CO2的條件下培養。

1.6 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA表達 取對數生長期的細胞用Trizol（Invitrogen, USA）提取總RNA。逆轉錄條件為30oC、10 min，42oC、40 min，99oC、5 min，5oC、5 min。PCR反應條件為：94oC、5 min，94oC、40 s，55oC、40 s，72oC、40 s，72oC、5 min。取擴增產物5 μL，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Image J軟件進行表達強度分析。引物均由遼寧博春天生物技術有限公司合成。PCR引物為：MMP-9上游5’-GCC ACT TGT CGG CGA TAA GG-3’；下游5’-CAC TGT CCA CCC CTC AGA GC-3’，243 bp。β-actin上游5’-AAA TCG TGC GTG ACA TTA A-3’；下游5’-CTC GTC ATA CTC CTG CTT G-3’，513 bp。

1.7 Western blot檢測MMP-9蛋白表達 收集細胞提取總蛋白。采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。取等量蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉印，一抗（anti-CCR7 1:200稀釋，anti-MMP-9 1:100稀釋）4oC孵育過夜，各自對應二抗（1:1 500稀釋）37oC孵育2 h，最后DAB顯色。EC3 Imaging System凝膠成像系統采集圖像，Image J軟件用于半定量分析特異性條帶的光密度值。實驗至少重復3次，取平均值。

1.8 統計學分析 采用SPSS 13.0統計學分析軟件，數據采用Mean±SD表示，對CCR7和MMP-9表達與臨床病理因素的關系用χ2檢驗；CCR7與MMP-9表達的關系采用Spearman等級相關分析，P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

圖1 90例非小細胞肺癌患者中CCR7和MMP-9的表達（SP，×200）。A和C為無淋巴結轉移組；B和D為有淋巴結轉移組。CCR7陰性表達（A），CCR7陽性表達（B），MMP-9陰性表達（C），MMP-9陽性表達（D）。Fig 1 The expressions of CCR7 and MMP-9 protein were detected in 90 specimens of human primary non-small cell lung cancer (SP, ×200). A and C are negative for lymphatic metastasis; B and D are positive for lymphatic metastasis. CCR7 negative expression (A), CCR7 positive expression (B),MMP-9 negative expression (C), MMP-9 positive expression (D).

2.1 CCR7和MMP-9蛋白的免疫組化檢測結果 CCR7主要表達于腫瘤細胞的胞質和（或）胞膜（圖1B），CCR7陽性率為70%（63/90）。MMP-9主要表達于癌細胞胞質（圖1D）， MMP-9陽性表達率為65.5%（59/90）。CCR7和MMP-9在有淋巴結轉移的腫瘤組織中高表達（圖1B、圖1D），而在無淋巴結轉移的腫瘤組織中低表達（圖1A、圖1C）。對CCR7和MMP-9的表達情況及其與NSCLC臨床病理特征的相關性進行統計分析，結果顯示：CCR7和MMP-9與NSCLC的臨床病理分期（P=0.003,P=0.001）和淋巴結轉移（P=0.004, P=0.003）有密切關系，而與年齡、組織學類型、分化程度無關（P＞0.05）（表1）。

2.2 NSCLC中CCR7的表達與MMP-9的關系 對CCR7和MMP-9低表達和高表達的數據進行比較，結果發現：CCR7與MMP-9的表達相關（r=0.342, P＜0.05）（表2）。

2.3 CCL21/CCR7上調BE1細胞中MMP-9的表達 為了闡明MMP-9是否為CCR7的下游效應分子，我們將BE1細胞分別經20 ng/mL和100 ng/mL CCL21處理24 h后，通過RTPCR和Western blot方法檢測MMP-9表達。結果表明，與對照組相比，CCL21處理組MMP-9 mRNA和蛋白水平均上調（P＜0.05），且具有劑量依賴性（圖2）。這些結果表明CCL21/CCR7可以上調肺癌BE1細胞中MMP-9的表達。

3 討論

CCR7是CC家族趨化因子受體成員之一，通過與其配體CCL21相互作用在淋巴細胞的歸巢過程中起重要作用。近來研究發現，CCR7在NSCLC[1,7,8]、乳腺癌[2]、頭頸部鱗癌[3]等多種腫瘤細胞中過表達，并且與這些腫瘤的淋巴結轉移密切相關。

腫瘤的侵襲和轉移是一個多因素、多步驟的復雜過程。MMP介導的細胞外基質及基底膜的降解是腫瘤侵襲轉移的一個關鍵步驟。研究[9-11]表明MMP-9在多種惡性腫瘤組織、培養的腫瘤細胞及癌基因轉化細胞中表達增強，體外侵襲實驗證實腫瘤細胞的高侵襲能力與MMP-9的表達增強有關。近來有研究[5,6]報道CCL21/CCR7可以調控結腸癌SW480細胞及慢性B細胞淋巴瘤細胞中MMP-9表達。基于以上理論基礎，我們認為NSCLC中CCR7可能上調MMP-9表達從而影響腫瘤的轉移。為此，我們運用免疫組化方法檢測了90例NSCLC組織中CCR7和MMP-9的表達。結果顯示CCR7與NSCLC患者

的臨床分期和淋巴結轉移密切相關，這與Takanami[1]的報道相一致；此外，我們還發現CCR7高表達組MMP-9高表達，統計學分析表明CCR7與MMP-9蛋白表達呈正相關（P＜0.05）。上述結果表明CCR7可能通過上調腫瘤細胞中MMP-9的表達影響腫瘤轉移。

表1 CCR7和MMP-9在非小細胞肺癌中的表達及其與臨床病理參數的關系Tab 1 Correlation of clinicopathologic parameters with CCR7 and MMP-9 expressions in non-small cell lung cancer

圖2 CCR7調控BE1細胞中MMP-9的表達。經CCL21處理后BE1細胞中MMP-9 mRNA（A）和蛋白（B）水平的表達情況。Fig 2 The expression of MMP-9 was regulated by CCR7 in BE1 cells. Expression of MMP-9 mRNA (A) and protein (B) in BE1 cells after CCL21 stimulation.

表2 非小細胞肺癌中MMP-9表達與CCR7表達的關系Tab 2 Relationship of the expressions of MMP-9 with CCR7

為了進一步闡明CCR7是否可上調NSCLC中MMP-9的表達，我們將BE1細胞經CCL21刺激24 h后發現，MMP-9的mRNA和蛋白表達水平明顯上調。因此，我們認為CCR7是誘導MMP-9表達的重要調節因子，但CCR7在NSCLC進展中調控MMP-9表達的精確機制有待更進一步的研究。

綜上所述，CCR7可以調控NSCLC中MMP-9的表達從而影響腫瘤的淋巴結轉移，同時本實驗也為MMP-9和CCR7成為NSCLC干預治療靶點提供了新的有力證據。