人肺腺癌TLE1 N端Q結構域片段在原核系統表達純化及其多克隆抗體的制備

王蘇 徐志飛 唐華 魏凌云 趙學維

TLE是Groucho蛋白家族在哺乳類動物中的同源物，作為轉錄共抑制分子，通過與Hairy、Tcf/Lef1、Runt等蛋白家族作用，形成轉錄抑制復合物，調控基因表達[1-4]。人TLE1基因定位于第9號染色體，全長2 310 bp，編碼770個氨基酸。TLE1蛋白是Notch信號通路下游重要調控蛋白，也可參與其它多個細胞信號通路傳導，如Shh、EGFR等，成為多種信號通路間相互影響、相互作用的重要靶點[5,6]。TLE1蛋白通過介導細胞的分化和發育，在胚胎發育、造血細胞發育分化、神經腫瘤尤其是惡性腫瘤生成等生理病理過程中起重要作用[7-9]。Allen等[8]通過組織芯片篩選實驗證實TLE1在肺腺癌中表達顯著增加，又在轉基因大鼠模型中發現Grg1過表達對肺腺癌生成有促進作用，因此認為TLE1與肺腺癌發生發展有密切關系。

在Groucho蛋白家族中，TLE1-4四種蛋白均在氨基端含有富含谷氨酰胺的Q結構域，在羧基端含有高度保守的特征WD40樣重復的結構域，此外TLE1還有3個保守性較低的結構域，分別是GP、SP和CcN。Q結構域作為TLE1蛋白兩個高度保守的特征性結構域之一，主要發揮兩部分生物學作用：寡聚化作用使TLE1形成四聚體，Q結構域關鍵基序點突變可導致寡聚化作用失敗，從而使其轉錄抑制功能失活[10,11]；Q結構域通過直接與蛋白分子如Tcf/Lef1、PRDI結合，形成轉錄共軛復合物，影響下游信號蛋白表達，調控信號通路，從而發揮生物學活性[12,13]。本實驗通過對人TLE1 N端Q結構域的表達純化，得到高純度的Q結構域蛋白片段TLE1-Q(1-136)，并成功制備其多克隆抗體，為解析TLE1-Q結構域蛋白結構、明確TLE1-Q結構域在Notch信號通路的作用方式、了解TLE1調控多條信號通路機理、理解TLE1促進肺癌生成機制打下基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株和表達載體 人肺腺癌cDNA文庫（由本室前期保存）；大腸桿菌E.coli BL21 condon plus及pGEX-4T-1載體由中科院上海生命科學院結構生物學平臺杜嘉木博士提供。

1.2 主要試劑 DNA膠回收試劑盒和質粒抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；KOD plus DNA聚合酶、dNTP、限制性內切酶BamHI和XholI連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；Ligation High DNA連接酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；Glutathion Sepharose 4B Fast Flow親和層析凝膠、快速蛋白液相色譜（FPLC）、Thrombin酶購自GE公司；純種新西蘭大白兔6只（雄性）購自第二軍醫大學實驗動物中心。

1.3 引物設計 根據GenBank中人類TLE1基因序列（NM_005077），Omiga 2.0設計引物，選取TLE1 N端第1-136氨基酸殘基，設計以BamHI、XholI為酶切位點。引物序列為：tle5’: ata gga tcc atg ttc ccg cag agc和tle3’: tat ctc gag tca gcc atg aga aag atg。

1.4 基因擴增 以人肺腺癌cDNA庫為模板，以tle5’和tle3’作引物，KOD plus DNA聚合酶擴增。PCR反應參數設置為94oC預變性5 min，94oC變性30 s，55oC退火30 s，68oC延伸30 s，30個循環后，68oC延伸10 min，4oC孵育20 min。

1.5 重組表達載體的構建及鑒定 人類TLE1 N端Q區基因PCR擴增產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以QIANGEN膠回收試劑盒，按標準說明書回收。回收產物及質粒載體pGEX-4T-1以BamHI和XholI限制性內切酶37oC酶切過夜。回收的酶切產物TLE1 N末端基因與pGEX-4T-1質粒以Ligtion High DNA連接酶16oC連接過夜。重組表達載體轉化感受態細胞E.coli BL21 condon plus，Amp抗性篩選重組陽性菌，命名為pGEX-4T1-TLE1-Q，PCR及BamHI、XholI雙酶切鑒定，送上海博尚生物公司測序。

1.6 TLE1 N端Q結構域的表達純化 pGEX-4T1-TLE1-Q菌株于LB 37oC培養至OD≈0.8，以0.5 mmol/L IPTG，16oC誘導過夜。離心收集菌體，以PBS（pH8.0）為破菌緩沖液，超聲波破菌。高速離心收集上清液，與Glutathion Sepharose 4B Fast Flow beads混合3 h，PBS（pH8.0）洗脫未結合蛋白，10 mmol/L還原性谷胱甘肽洗脫融合目的蛋白GST-TLE1-Q(1-136)。100 U Thrombin 4oC，酶切16 h，透析至PBS（pH8.0），再次親和純化，去除GST-tag。以PBS 0.1%Chaps（pH8.0）洗脫目的蛋白TLE1-Q(1-136)，FPLC純化，SDS-PAGE分析純度。

1.7 多克隆抗體的制備 以純化蛋白分別免疫新西蘭大白兔，將300 μg TLE1-Q(1-136)蛋白與完全弗氏佐劑等體積混合充分乳化后，背部皮下多點注射初次免疫，21 d后200 μg TLE1-Q(1-136)蛋白與等體積的不完全弗氏佐劑混合乳化后，頸背部皮下多點加強免疫，加強免疫2次后，采心臟血，制備抗血清分離血清，分裝儲存于-20oC保存。間接ELISA法檢測多克隆抗體效價。

1.8 Western blot分析 以pGEX-4T-1空載體轉化的E.coli BL21 condon plus為陰性對照，純化的TLE1-Q(1-136)蛋白經SDS-PAGE電泳，電轉移（100 V，2 h，冰水浴）至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉，將制備的多克隆抗體（1:1 000稀釋），4oC孵育過夜。1‰TBST洗膜，10 min/次，共3次，加入帶HRP標記的羊抗兔二抗（1:2 000稀釋），室溫下孵育1 h，1‰TBST洗膜，15 min/次，共3次，最后加入化學熒光試劑，壓片，曝光，拍照。

圖1 重組質粒pGEX-4T1-TLE1-Q的PCR及雙酶切鑒定Fig 1 Identification of vector pGEX-4T1-TLE1-Q by PCR and digested with BamHI and Xho1I

圖2 重組蛋白GST-TLE1-Q(1-136)的SDS-PAGE 鑒定Fig 2 SDS-PAGE of recombinant protein GST-TLE1-Q(1-136)

2 結果

2.1 TLE1 N端Q區基因擴增鑒定 以構建的pGEX-4T1-TLE1-Q質粒載體為模板，以tle3’及tle5’為引物PCR擴增，雙酶切后分別出現大小約408 bp的特異性條帶，與目的大小片段相一致（圖1）。測序結果顯示所獲得的TLE1第1-136位氨基酸殘基樣品序列編碼框架完整，編碼區為408 bp，編碼136個氨基酸殘基。經Pubmed網站Blast分析，與人類基因組TLE1基因序列同源性為100%，編碼TLE1蛋白N末端第1-136個氨基酸。

2.2 重組人TLE1 N端Q結構域蛋白的表達及純化結果 目的TLE1-Q(1-136)蛋白表達純化后，以13.5%SDS-PAGE對全菌，上清，洗脫、酶切及純化產物蛋白行鑒定分析。SDS-PAGE表明經一步親和純化，還原型谷胱甘肽洗脫，可以得到分子量約為41 000 Da左右的重組蛋白GST-TLE1-Q(1-136)。Thrombin酶切后，41 000 Da目的條帶切開成為大小約26 000 Da和14 000 Da兩條條帶。再次經親和、FPLC純化，可得到大小約14 000 Da的目的蛋白TLE1-Q(1-136) （圖2）。

2.3 TLE1 N端Q結構域蛋白多克隆抗體效價及特異性測定 純化的TLE1 N端Q結構域蛋白TLE1-Q(1-136)以（0.1 μg/mL）每孔100 μL包被，ELISA法檢測多克隆抗體效價，制備的抗血清效價達1:20 000。對TLE1-Q(1-136)蛋白經自制抗體行免疫印跡檢測，可見一條分子量約14 000 Da的清晰條帶，與預期結果相符，陰性對照未見明顯條帶，證明制備的抗體特異性較好（圖3）。

圖3 TLE1-Q(1-136)多克隆抗體的Western blot鑒定Fig 3 Identification of polyclonal antibody by Western blot

3 討論

Gro/TLE家族作為轉錄共抑制分子，本身不與DNA直接結合，通過結合轉錄抑制蛋白形成復合物，對靶基因起“長程”轉錄抑制作用[4,14]。Groucho/TLE蛋白分子中具有兩個高度保守的特征性結構域，分別是：位于羧基端的含有多個色氨酸-天門冬氨酸二肽序列的WD40結構；位于氨基端的由130個氨基酸組成、富含谷氨酰胺的Q結構域。前期研究認為TLE1通過WD結構域與WRPW、Eh基序結合形成復合物，該復合物經N-末端由第1-136位氨基酸組成的Q結構域來發揮其轉錄抑制活性，可能機制為TLE1通過位于Q結構域的2個亮氨酸拉鏈狀的α螺旋，形成四聚體抑制轉錄活性[10]。實驗證實將亮氨酸突變后，TLE/Gro無法形成四聚體，失去轉錄抑制活性，分析認為TLE分子中第50-110位氨基酸殘基對四聚體的形成起到關鍵作用[11]。近來亦有研究[13,15]表明Q結構域不僅介導TLE及其家族蛋白之間的四聚化作用，也可直接結合Tcf/Lef1、gp130等轉錄調控因子，參與信號通路調控。本實驗即選取TLE1第1-136位氨基酸殘基TLE1-Q(1-136)即Q結構域所在片段進行表達純化研究。

在原核系統中表達真核蛋白，蛋白的正確折疊是難點之一。蛋白的可溶性是由蛋白結構的空間折疊方式決定的，不同的折疊方式也可影響到蛋白分子上抗原決定簇，進而影響抗體的特異性與效價[16]。由于富含谷氨酰胺的蛋白在溶液中的可溶性較差[17]，我們通過16oC低溫誘導，控制蛋白生成速度，使目的蛋白以合適的速度轉錄、翻譯，從而使其正確折疊，并借助GST-tag的助溶性，在上清中形成可溶的重組蛋白；同時GST-tag也為蛋白的純化提供了親和位點。SDS-PAGE電泳證實獲得較高純度的可溶重組蛋白GST-TLE1-Q(1-136)，相對分子質量約為41 000 Da。由于無GST-Tag的TLE1蛋白的Q結構域性狀更接近體內真實天然狀態，并利于后期研究；且GST標簽（26 000 Da）較Q結構域（14 000 Da）更大，用重組蛋白在制備抗體過程中可能會造成抗體的特異性和效價降低。我們嘗試以Chaps為去垢劑，幫助維持蛋白在溶液中的穩定溶解狀態，并以Thrombin酶切去除GST標簽，最終得到相對分子質量約為14 000 Da、純度高、特異性強、穩定可溶的TLE1N端Q結構域蛋白TLE1-Q(1-136)。用該純化蛋白免疫家兔，成功制備該蛋白的多克隆抗體，ELISA檢測效價為1:20 000，經Western blot與純化蛋白TLE1-Q(1-136)免疫雜交出現條帶，與預期結果一致，證實我們抗體制備成功，且具有高度的特異性。

TLE/Gro參與Shh、EGFR、Notch等多個信號通路的活化后調控，在信號通路活化、高等動物胚胎發育等生理病理過程中起到重要作用[4,6]。TLE1作為以上信號通路的關鍵調控點，重要機制之一就是通過TLE1 N端Q結構域結合Tcf/Lef1、FoxA、c-Myc、PRDI等相關蛋白而引起轉錄調節因子活性的改變，或介導四聚體形成轉錄抑制復合物，實現對目的基因轉錄的調控，引起胚胎發育，腫瘤增殖等一系列病理生理變化，但其具體分子作用機制尚不十分明晰。本實驗研究成功制備可溶TLE1 N端Q結構域蛋白TLE1-Q(1-136)及其多克隆抗體，為下一步開展針對TLE1 Q結構域的蛋白結構功能研究，了解TLE1參與信號通路調控機制，探討TLE1在肺癌的發生發展中的作用奠定了前期研究基礎。