混合5’-核苷酸的分離與檢測

李 黎 莫曉燕* 陳雪玉

實驗研究

混合5’-核苷酸的分離與檢測

李 黎 莫曉燕* 陳雪玉

以核酸酶P1酶解RNA產物為材料，對離子交換樹脂分離混合5’-核苷酸的工藝條件進行研究，并通過建立的RP-HPLC檢測方法鑒定單核苷酸分離效果。結果表明，陽離子交換樹脂NH-1可使4種單核苷酸有效分離，洗脫順序依次為UMP→GMP→CMP→AMP；最佳分離條件為：色譜柱徑高比＝1∶20，RNA酶解液上樣濃度20g/L，吸附時間8h，洗脫流速0.5mL/min。確定RP-HPLC C18反相柱的色譜條件為：流動相KH2PO4-甲醇，在30mmol/L KH2PO4（pH 5.5）以及0.5mL/min流速條件下，按照KH2PO4∶甲醇=100∶0→97∶3，15min，97∶3→95∶5，1min進行梯度洗脫。通過外標法對混合單核苷酸的分離效果進行檢測，證明增加吸附時間是改善分離效果的重要因素。

5’-核苷酸；陽離子交換樹脂；反相高效液相色譜；分離和檢測

核苷酸及其衍生物是醫藥、食品、農業和科研領域重要的生化試劑和原料，與國外相比，國內核苷酸工業發展緩慢，尤其是混合核苷酸的分離純化工藝大多處于分離率差、純化效率低的狀況[1-3]。本文采用陽離子交換樹脂對核酸酶P1酶解RNA的核苷酸混合液進行分離純化研究[4-6]，并且探討4種單核苷酸的RP-HPLC檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

核苷酸混合液（核酸酶P1酶解RNA產物，自制）；NH-1陽離子交換樹脂（西安藍深生物科技有限公司）；AMP、CMP、GMP、UMP標準品（美國Sigma公司）；甲醇（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

DU-640紫外可見分光光度計（美國BECKMAN儀器有限公司）；125-168高效液相色譜儀（美國BECKMAN儀器有限公司）；BS-100A自動部分收集器（上海精科實業有限公司）；HL-2恒流泵（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樹脂的選擇與處理

根據待分離核苷酸的電荷特性，選擇強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂NH-1作為分離介質，該樹脂具有上柱量大、分離度高的特點，適合于工業化生產[7-9]。

稱取適量NH-1陽離子交換樹脂，蒸餾水浸泡2h除去雜質顆粒；加四倍樹脂量的1mol/L NaOH溶液浸泡4h，蒸餾水水洗至中性；以四倍樹脂量的1mol/L HCl浸泡4h，蒸餾水水洗至中性；再用pH 1.5的HCl浸泡樹脂，使樹脂轉為氫型后置冰箱保存待用。

1.3.2 混合單核苷酸的分離純化及鑒定

以核酸酶P1酶解酵母RNA獲得的核苷酸混合液上樣，NH-1強酸型陽離子交換樹脂吸附，蠕動泵控制流速，蒸餾水洗脫，使用部分收集器收集洗脫液，每管10～14mL。將收集的洗脫液依次測定254nm吸收值（A254nm）并繪制洗脫曲線。分別考查了上樣液濃度、洗脫液流速以及樹脂吸附時間與單核苷酸洗脫曲線的關系。

1.3.2.1 上樣液濃度

分別采用5g/L和10g/L的RNA酶解液上樣，色譜柱徑高比為1∶15，在洗脫流速1mL/min的條件下繪制洗脫曲線。

1.3.2.2 洗脫液流速

以20g/L 的RNA酶解液上樣，色譜柱徑高比為1∶20，分別在洗脫流速0.5和1mL/min的條件下繪制洗脫曲線。

1.3.2.3 樹脂吸附時間

以20g/L的RNA酶解液上樣分別吸附0、3和8h，色譜柱徑高比為1∶20，在洗脫流速05mL/min的條件下繪制洗脫曲線。

1.3.2.4 單核苷酸的鑒定

取0.7mL洗脫液溶于1mL KH2PO4-NaOH緩沖液（pH 7.0）中，混勻后測定其在220～300nm波長范圍內的紫外吸收值，根據4種核苷酸的紫外吸收光譜特性（表1）鑒定單核苷酸種類。

表1 4種單核苷酸的紫外吸收光譜特性

1.3.3 混合單核苷酸的RP-HPLC檢測

反相色譜是迄今在高效液相色譜中應用最廣泛的技術，主要是因為它適用于分析絕大多數的非極性物質和很多可離子化的化合物[10-12]。本文通過優化色譜條件建立反相高效液相色譜檢測核苷酸的方法，并運用外標法對混合5’-單核苷酸的分離效果進行檢測。

首先對色譜條件進行優化選擇，采用單一標準核苷酸分別進樣，流動相為pH 5.5的KH2PO4與甲醇（95∶5），進樣濃度為0.1mg/L，檢測波長為260nm。

1.3.3.1 鹽濃度

分別在流速1和0.5mL/min的條件下，考查了10～30mmol/L KH2PO4溶液濃度對4種標準核苷酸保留時間的影響。

1.3.3.2 流速

在流動相為10mmol/L KH2PO4條件下，改變流速（1、0.8、0.5、0.3mL/min），檢測4種標準核苷酸的保留時間。

1.3.3.3 pH

在30mmol/L KH2PO4溶液、流速0.5mL/min條件下，改變KH2PO4溶液的pH（4.5、5.5、6.5），檢測4種標準核苷酸的保留時間。

1.3.3.4 梯度洗脫

在30mmol/L KH2PO4溶液、流速0.5mL/min條件下，分別采用KH2PO4∶甲醇=100∶0→95∶5，10min；KH2PO4∶甲醇=100∶0→95∶5，20min；KH2PO4∶甲醇=100∶0→97∶3，15min，97∶3→95∶5，1min不同條件梯度洗脫，考查4種標準核苷酸保留時間。

在選擇的最佳色譜條件下，以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L不同濃度的4種標準核苷酸混合液分別進樣，根據峰面積和濃度制作標準曲線。將前述陽離子交換樹脂分離的4種單核苷酸樣品進行RP-HPLC檢測，根據峰面積和標準曲線分別計算4種核苷酸的濃度。

2 結果與討論

2.1 混合單核苷酸的分離條件

2.1.1 上樣液濃度對洗脫曲線的影響

不同濃度酶解液上樣洗脫曲線如圖1。由實驗結果可知，NH-1強酸型陽離子交換樹脂可將混合核苷酸分離得到4種單核苷酸，但是5g/L上樣液時第4個峰峰值偏小；增加濃度至10g/L后4個峰均明顯，第4個峰值有所提高。對于一定量的樹脂而言，條件相同的情況下，可吸附核苷酸的質量是一定的，所以在一定范圍內增加上柱液濃度，有利于更多的樣品被吸附，提高分離效率。

2.1.2 流速對洗脫曲線的影響

圖1 不同上樣液濃度對混合核苷酸分離的影響

不同流速的洗脫曲線如圖2。由實驗結果可知，洗脫流速為1mL/min時，4個峰可以基本分離，但是峰值小，并且雜峰較大；降低流速至0.5mL/min后，各個峰值增加明顯，雜峰明顯減小。在交換層析時，為了保證有效交換，兩相需要有充分的接觸時間，若接觸時間短則有可能導致吸附不完全，出現洗脫液重疊交叉，不能完全分開的問題，所以適當降低流速有利于增加兩相的接觸時間，提高吸附效果從而改善分離效率。

圖2 不同流速對混合核苷酸分離的影響

2.1.3 吸附時間對洗脫曲線的影響

相同條件下改變吸附時間的結果見圖3。從混合核苷酸洗脫曲線可知，隨著吸附時間延長，核苷酸的分離效果有所提高，吸附8h洗脫曲線中4個峰的分離效果明顯好于吸附3h和吸附0h。兩相的有效吸附是分離的重要條件之一，增加吸附時間，是保證兩相充分吸附的最直接簡便的方法，可以有效改善分離效果。

2.2 單核苷酸的定性鑒定

圖3 不同吸附時間對混合核苷酸分離的影響

采用分光光度法檢測單核苷酸的種類，結果見表2。將得出的數值與表1進行對比，鑒定出4種核苷酸的洗脫順序為UMP、GMP、CMP、AMP，此洗脫順序符合分離原理，進一步證實本研究的分離條件和分離方法有效。

表2 4種單核苷酸定性鑒定結果

2.3 混合單核苷酸RP-HPLC的色譜條件

2.3.1 鹽濃度對分離效果的影響

不同流速條件下改變 KH2PO4溶液濃度，檢測各標準核苷酸的保留時間，結果見表3。可以看出，相同流速條件下，隨著流動相鹽濃度的提高，4種樣品保留時間不同程度延長，分離度有所提高；而同一鹽濃度時，降低流速效果更佳。例如流速為0.5mL/min時，當KH2PO4溶液從20mmol/L 增加到30mmol/L，CMP和UMP的分離度由0.45上升至0.52，因此選定30mmol/L KH2PO4溶液為最佳鹽濃度。

表3 不同鹽濃度的單核苷酸保留時間（min）

2.3.2 流速對分離效果的影響

不同流速對各標準核苷酸保留時間的影響結果見表4。結果顯示，隨著流速減小，單核苷酸的分離度逐漸增加，保留時間也隨之延長。當流速為0.3mL/min時，CMP和UMP的分離度為0.31；而流速為0.5mL/min時，4種核苷酸保留時間基本分開，CMP和UMP的分離度為0.29。綜合鹽濃度考察結果，確定0.5mL/min為流動相的最佳流速。

表4 不同流速的單核苷酸保留時間（min）

2.3.3 pH對分離效果的影響

不同KH2PO4溶液pH條件下，檢測的各標準核苷酸保留時間結果見表5。由結果可知，流動相的pH變化對單核苷的保留時間有不同程度的影響。當KH2PO4溶液的pH為4.5時，4種核苷酸的保留時間非常接近，幾乎無法分開，分析原因是由于核苷酸隨流動相pH降低，其有機酸的解離性質被抑制；pH升高至5.5時，隨著核苷酸的解離，各單核苷酸的保留時間有所增加，4種核苷酸基本分開；但是pH至6.5時，4種核苷酸的分離程度下降，CMP和UMP的分離度（0.41）＜pH 5.5的分離度（0.52）。因此，選擇pH為5.5為KH2PO4溶液的最佳色譜條件。

表5 不同pH的單核苷酸保留時間（min）

2.3.4 梯度洗脫對分離效果的影響

分析單一標準核苷酸的檢測結果可知，AMP分離效果較好，CMP、UMP和GMP可基本分離但是效果不理想，特別是CMP和UMP保留時間較近，在核苷酸混合液走樣時有重疊的可能。因此，進一步探索不同梯度洗脫條件對各標準核苷酸保留時間的影響，結果見表6。KH2PO4溶液與甲醇比例從100∶0降至95∶5的梯度洗脫，4種核苷酸保留時間有所延長，GMP可以分開，但CMP與UMP保留時間仍較為接近。采用15min內KH2PO4溶液與甲醇比例從100∶0降至97∶3，再于1min內將二者比值降至95∶5，避免AMP保留時間過長，此時CMP與UMP分離效果較好。

表6 不同梯度洗脫條件的單核苷酸保留時間（min）

最終獲得的RP-HPLC色譜條件為：流動相30mmol/L KH2PO4（pH 5.5）-甲醇，流速0.5mL/min，梯度洗脫條件KH2PO4∶甲醇=100∶0→97∶3，15min，97∶3→95∶5，1min，檢測波長：260nm。混合單核苷酸檢測結果如圖4，在此條件下4種核苷酸可以有效分離。

圖4 混合單核苷酸RP-HPLC圖譜

2.4 標準曲線及核苷酸的定量測定

在選擇的最佳色譜條件下制作標準曲線見圖5，不同吸附時間條件下分離的4種核苷酸測定結果如圖6和圖7。由實驗結果可知，增加吸附時間，分離得到的單核苷酸濃度有不同程度的增加，進一步說明，兩相的有效吸附是分離的重要因素，增加吸附時間是保證兩相充分吸附的最直接有效方法。

3 結 論

采用NH-1陽離子交換樹脂分離核酸酶P1酶解RNA產物，最佳分離條件為：RNA酶解液上樣濃度20g/L，色譜柱徑高比1∶20，吸附8h，洗脫流速0.5mL/min，可將混合核苷酸有效分離，分光光度法檢測鑒定單核苷酸的洗脫順序依次為UMP、GMP、CMP、AMP。

圖6 樣品單核苷酸RP-HPLC圖譜

圖7 不同吸附時間混合核苷酸的分離結果

建立了反相高效液相色譜檢測核苷酸的方法，得到的最佳色譜條件為：流動相KH2PO4-甲醇，在30mmol/L KH2PO4（pH 5.5）以及0.5mL/min流速條件下，按照KH2PO4∶甲醇=100∶0→97∶3，15min，97∶3→95∶5，1min進行梯度洗脫。通過外標法對混合單核苷酸的分離效果進行檢測，證明增加吸附時間是改善分離效果的重要因素。

[1] 廖紅東,莫曉燕.核酸酶P1研究進展[J].藥物生物技術,2004,11(3):190-193.

[2] 錢敏,李關榮,魯成.核糖核酸研究進展[J].蠶業科學,2004,30(2):185-190.

[3] 張志軍,溫明浩,王克文,等.核苷酸生產技術現狀及展望[J].現代化工,2004,24(11):19-23.

[4] 徐燚.核苷酸制備工藝的研究[D].南京:南京工業大學,2002.

[5] Cihlar T,Rosenberg I.Ef fi cient separation of natural ribonucleotides by low-pressure anion-exchange chromatography[J].J.Chromatog,1993,644(2): 299-305.

[6] 王光柱.5’-混合脫氧單核苷酸分離純化的工藝研究[D].杭州:浙江大學,2006.

[7] 肖林平,徐正軍,何明芳,等.NH-1分離5’-核苷酸的研究[J].離子交換與吸附,2003,19(5):430-436.

[8] Halder A,Sa B.Preparation and in vitro evaluation of polystyrenecoated diltiazem-resin complex by oil-in-water emulsion solvent evaporation method[J].AAPS Pharm SciTech,2006,7(2): 105-112.

[9] Ozawa M,Koyama S,Suzuki T.Innovative separation method for advanced spent fuel reprocessing based on tertiary pyridine resin[J].Czechoslovak J Phys,2006,56(1): 579-587.

[10] 鄒耀洪.香菇中5’-核苷酸的高效液相色譜-質譜分析[J].食品科學,2005,26(1):196-198.

[11] Brockstedt U,Pfau W.Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatographic Separation of 32p-Labeled Nucleotlde Adducts Formed by Food-Derived Carcinogenic Aminoimidazoazarenes[J].Chromatographia,1999,50(9):547-552.

[12] Shimelis O,Giese RW.Nuclease P1 digestion/high-performance liquid chromatography,a practical method for DNA quantization [J].J Chromatography A,2006,1117(1):132-136.

Q524

B

1671-8194（2010）21-0045-04

西安交通大學生命科學與技術學院（710049）