FMRP影響小鼠小腦皮質神經元發育與遷移的實驗研究

孫曉紅，董玉霞，馮昱，宋衛科，何悅，何志義

（中國醫科大學 1.附屬第四醫院神經內科，沈陽 110032；2.附屬第一醫院神經內科，沈陽 110001）

脆性X智力障礙蛋白（fragile X mental retardation protein，FMRP）是脆性X智力障礙1（fragile X mental retardation 1，Fmr1）基因的編碼產物，Fmr1 基因（CGG）區擴增突變導致該基因沉默致使FMRP不表達或低表達［1，2］，是導致脆性 X 綜合征（fragile X syndrome，FXS）的主要原因。目前研究發現，20%～30%FXS患者伴癲癇發作［3］，因此，小腦中調節神經興奮性的谷氨酸（glutamatergic acid，Glu）和γ氨基丁酸（gamma aminobutyric acidergic acid，GABA）神經核團的形態與功能的變化，成為FXS發病機制的研究熱點。本實驗旨在通過對胚胎發育期小鼠小腦神經元形態學的研究探討FMRP缺失對小腦神經元發育遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 質粒構建、轉染及FXS陽性小鼠類型鑒定

將I304N錯譯突變基因插入全長的哺乳動物Fmr1cDNA，構建FMRPmutant-pEGFP與pEGF質粒；將質粒轉染入胚胎小鼠側腦室，轉染濃度為pEGFP 1.3 μg/μl，FMRPmutant-pEGFP 1.3 μg/μl；并對鼠尾組織進行PCR鑒定小鼠基因型，具體操作步驟見前期實驗［4］。pEGFP組為對照組，FMRPmutantpEGFP為實驗組。

1.2 腦組織取材與染色

胚胎17 d對小鼠小腦組織進行取材，4%多聚甲醛固定過夜，脫水透化處理后制成蠟塊，切片機切成20 μm的冠狀切片。分別進行Nissl染色及免疫熒光染色，免疫熒光染色所用一抗為兔抗GFP（1∶500），兔抗 Tbr2（1∶2 000）；二抗為 Alexa Fluor-488山羊抗兔（1∶1 000）。

1.3 圖像獲取及數據分析

用連有Olympus BX51熒光共聚焦顯微鏡的MicroFire S099808的數碼相機獲取高分辨率的圖片，Image-Pro Plus version6進行圖像分析。

2 結果

2.1 Nissl染色觀察小腦深部核團與浦肯耶細胞（Purkinje cell，PC）

大體標本觀察到實驗組胚胎小鼠小腦較對照組略小，冠狀切片尼氏染色顯示，對照組小鼠小腦細胞較大而圓，排列整齊，位于外顆粒層與內顆粒層間形成PC細胞層（圖1A），而實驗組PC較小，呈現非極性紊亂排列，核仁固縮濃染等特征，部分細胞滯留于內層顆粒細胞層而無法正常移行入PC細胞層（圖1B）。小腦深部核團（deep cerebellar neuclei，DNC）包括3種核：頂核、中間核和齒狀核，Nissl染色顯示對照組小鼠小腦中間核和齒狀核核排列緊密，無明顯界限（圖1C），而實驗組中間核和齒狀核核體積縮小，核團間彼此分離，被白質（white matter，WM）分隔（圖1D）。

2.2 免疫熒光染色觀察小腦單極刷狀緣細胞表達及分布

T 盒轉錄因子（T-box transcription factor，Tbr2）是單極刷狀緣細胞（unipolar brush cell，UBC）標志物。免疫熒光染色顯示Tbr2標記的UBC陽性細胞主要分布在小腦側腦室區（ventricular zone，vz），對照組Tbr2陽性細胞分別從菱唇（rhombic lip，rl）與外顆粒層途經白質形成兩條遷移路徑（圖1E），而實驗組Tbr2陽性細胞僅存在由從菱唇經白質一條遷移路徑，并在小腦側腦室區異常聚集（圖1F）。

3 討論

小腦主要包含兩大類功能性核團：谷氨酸鹽神經元和γ氨基丁酸鹽神經元，小腦皮質發育過程中這兩類神經元發育遷移等形態學變化影響著小腦興奮性功能通路與抑制性功能通路的平衡［5］。谷氨酸鹽神經元包括 DNC、UBC 及顆粒細胞（Granule），γ氨基丁酸鹽神經元包括PC和抑制性中間神經元。

實驗結果表明對照組小鼠小腦中間核和齒狀核核排列緊密，無明顯界限，而實驗組中間核和齒狀核核體積縮小，核團間彼此分離，被白質分隔，提示FMRP缺乏時小腦新皮質神經元前體細胞生成及移行異常，可能是導致FXS患者認知障礙及行為異常的原因之一；Tbr2是發育小鼠小腦內UBC標志物［6］，Tbr2陽性細胞在側腦室區異常聚集與遷移路徑的改變提示小腦內谷氨酸鹽神經元的生成和遷移出現異常［7］。此外，實驗組PC呈現非極性紊亂排列，核仁固縮濃染等特征，部分細胞滯留于內層顆粒細胞層而無法正常移行入PC細胞層，提示FMRP缺失可能對PC產生影響導致FXS患者癲癇癥狀的發生［8］。

綜上，本實驗發現FMRP缺失時小腦興奮性及抑制性兩類神經元的發育遷移均出現異常，這有助于進一步探討FXS患者和Fmr1基因敲除小鼠認知障礙和癲癇的發生機制，為早期預防與治療提供實驗依據。

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