結直腸癌組織中MAC30的表達及其臨床意義

趙增仁，張麗靜，張志勇，張學明，胡月明，李芳，孫曉峰

（1.河北醫科大學 第一醫院普外科，石家莊 050031；2.唐山市工人醫院 病理科，河北 唐山 063000）

腦膜瘤相關蛋白（meningioma-associated protein，MAC30）首先發現在腦膜瘤中呈過度表達［1］，隨后發現其在乳腺癌、胃癌和結直腸癌中表達也上調，但在胰腺癌中表達減少或缺失［2］。我們采用免疫組織化學法檢測MAC30蛋白在結直腸癌組織、正常黏膜及轉移淋巴結中的表達水平，同時檢測結直腸癌及正常黏膜中MAC30mRNA的表達，分析其與結直腸癌臨床病理特征間的關系，探討MAC30在結直腸癌發生、發展及預后中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

收集唐山市工人醫院2007年1月至2008年12月的結直腸癌石蠟存檔蠟塊共130例，包括對應病例的正常黏膜組織73例，淋巴結轉移癌組織34例。收集2007年10月至2009年1月50例來自河北醫科大學第一醫院、唐山市工人醫院和河北醫科大學第四醫院結直腸癌手術標本。每例標本分別取自結直腸原發腫瘤組織、距腫瘤2 cm的無瘤黏膜組織、近端和遠端切緣正常黏膜組織（直腸癌無遠端切緣黏膜）。新鮮標本離體后迅速置于液氮中，于-80℃保存。所有患者術前未接受任何化療和放療。年齡31～90歲，平均57.6歲。其中男性31例，女性19例；≤60歲30例，>60歲20例；中高分化41例，低分化9例；無淋巴結轉移27例，淋巴結轉移23例。

1.2 主要試劑

鼠抗人MAC30單克隆抗體由孫曉峰教授饋贈，S-P免疫組化試劑盒（北京中山生物技術有限公司）、Trizol試劑（Invirotrogen）、cDNA第一鏈合成試劑盒（Fermentas）、TaqDNA 聚合酶（Promega）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色及結果判定：采用S-P兩步法，按試劑盒說明書進行操作。用0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。MAC30染色陽性物質主要定位于細胞質，呈棕黃色顆粒。高倍鏡下隨機選取5個視野（每個視野觀察細胞數不少于200個），按切片中細胞著色深淺評分：細胞無顯色為-，淺黃色為+，棕黃色為++，棕褐色為+++。

1.3.2 結直腸癌組織MAC30mRNA表達測定：采用逆轉錄聚合酶鏈反應法（RT-PCR），按照試劑盒說明提取組織中的總RNA，將RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，PCR擴增MAC30及β-actin基因片段。MAC30引物序列，上游：5′ACTGCTCAGAACCCACGTCT 3′，下游：5′ATCATGCCACTGCCCTTTAC 3′，擴增產物片段長度為 168 bp；β-actin 引物序列，上游：5′GGAAATCGTGCGTGACATTA 3′，下游：5′GGAGCAATGATCTTGATCTTC 3′，擴增產物片段長度為379 bp；引物由北京塞百盛生物有限公司合成。PCR 反應體系為：cDNA 2 μl，TaqDNA 聚合酶 0.125 μl，上下游引物各 10 pmol，10 mmol/L dNTPs 1 μl，補 DEPC 處理過的水至終體積 25 μl。反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環，最后72℃延伸7 min。取PCR反應產物5 μl置2%瓊脂糖凝膠電泳、采用凝膠成像及圖像分析軟件對電泳條帶進行分析。根據MAC30與β-actin條帶灰度比半定量分析MAC30mRNA的表達水平。

1.4 統計學分析

選用SPSS 13.0統計軟件對實驗結果進行χ2檢驗、t檢驗、方差分析。MAC30表達和生存期之間的關系采用Cox回歸模型。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MAC30在不同結直腸組織中的表達

MAC30在結腸正常黏膜組織中表達較弱，其表達強陽性率為11%（8/73）；結直腸癌組織及轉移淋巴結中MAC30染色較強，130例結直腸癌組織中MAC30表達強陽性率為48%（62/130），轉移淋巴結中為65%（22/34）；結直腸癌組織及轉移淋巴結中MAC30的表達遠遠高于正常黏膜（P＜0.01）。見圖1。

2.2 MAC30mRNA在不同結直腸組織中的表達

MAC30mRNA在結直腸癌組織的表達（0.57±0.36）較癌旁無瘤黏膜（0.35±0.25）、近端（0.34±0.25）及遠端正常黏膜（0.35±0.28）的表達明顯增強（P＜0.01）；癌旁無瘤黏膜、近端及遠端正常黏膜中MAC30mRNA的表達無明顯差別（P＞0.05）。見圖2。

2.3 結直腸癌組織中MAC30mRNA的表達與臨床病理特征的關系

在黏液癌/印戒細胞癌中MAC30mRNA的表達水平（0.80±0.40）較非粘液癌（0.48±0.29）明顯增高（P＜0.01）。伴淋巴結轉移者MAC30mRNA的表達水平較不伴有淋巴結轉移者高，但差別無統計學意義。見表1。

2.4 MAC30mRNA的表達與結直腸癌患者生存期的關系

對結直腸癌患者術后生存期進行評估，以中位數為界，將其分為高表達和低表達兩組。結直腸癌中MAC30mRNA高表達的患者3年生存率明顯低于MAC30弱表達患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

MAC30位于染色體 17q11.2，1993年 Murphy等［1］發現該蛋白在腦膜瘤中高表達，因此而命名。2004年Kayed等首次發現MAC30在正常結腸、胃、食管及胰腺組織中均有表達。MAC30mRNA及蛋白在人多種腫瘤中表達水平不同，如：在胰腺癌和腎癌中低表達，在卵巢癌、食道癌、胃癌和結腸癌中高表達［2］。在一項前期研究中，我們發現直腸癌患者無論術前是否曾接受放療，MAC30蛋白的表達均明顯上調，并且在浸潤性生長的腫瘤中其表達也增加［3］。本次試驗發現，從遠端正常結腸黏膜→原發癌組織→淋巴結轉移灶，MAC30蛋白表達逐漸增強，在原發癌組織中表達顯著高于正常黏膜。同時，MAC30mRNA在結直腸癌組織的表達較癌旁無瘤黏膜、近端及遠端正常黏膜的表達明顯增強，與MAC30蛋白表達一致，表明MAC30mRNA在結直腸癌的發生發展中起一定的促進作用。

表1 MAC30mRNA表達與結直腸癌臨床病理特征的關系（±s）Tab.1 Relationship ofMAC30mRNA expression in primary tumor with clinicopathologic features（±s）

表1 MAC30mRNA表達與結直腸癌臨床病理特征的關系（±s）Tab.1 Relationship ofMAC30mRNA expression in primary tumor with clinicopathologic features（±s）

Variables n MAC30mRNA expression tvalue P-value Histology -2.739 0.009 Non-mucinous 40 0.48±0.29 Mucinous/signet-ring cell 10 0.80±0.40 Differentiation 0.561 0.578 Better/moderate 41 0.55±0.35 Worse 9 0.47±0.26 Lymph nodes metastasis－0.616 0.541 No 27 0.48±0.24 Yes 23 0.52±0.26

另外，MAC30mRNA在結直腸癌組織中的表達上調與腫瘤的組織學類型密切相關，黏液/印戒細胞癌中MAC30mRNA的表達較非黏液性腺癌的表達水平明顯增高，這可能解釋了為什么MAC30的表達和患者預后有關。目前許多證據表明，結直腸黏液癌/印戒細胞癌病人預后較非黏液癌病人更差［4，5］，黏蛋白可能通過分泌唾液酸殘渣遮蔽抗原表位而干擾腫瘤細胞的免疫識別和淋巴細胞的浸潤。隨后，我們對患者生存期進行研究，發現MAC30mRNA在結直腸癌中的表達水平和患者的3年生存期密切相關，MAC30mRNA高表達的患者3年生存率較低。這證實MAC30mRNA的表達上調和結直腸癌患者的預后不良有關，MAC30的高表達可作為評估患者臨床預后的一項生物學指標。

MAC30的高表達和腫瘤的組織學類型及患者預后不良有關，提示MAC30在結直腸癌進程中發揮著重要作用，故我們推測MAC30可以作為腫瘤診斷、惡性進展及預后判斷的有效指標，并可能為結直腸癌的基因治療提供有效靶點。

［1］Murphy M，Pykett MJ，Harnish P，et al.Identification and characterization of genes differentially expressed in meningiomas ［J］.Cell Growth Differ，1993，4（9）：715-722.

［2］Kayed H，Kleeff J，Ding J，et al.Expression analysis of MAC30 in human pancreatic cancer and tumors of the gastrointestinal tract［J］.Histol Histopathol，2004，19（4）：1021-1031.

［3］Zhang ZY，Zhao ZR，Adell G，et al.Expression of MAC30 in rectal cancers with or without preoperative radiotherapy ［J］.Oncology，2006，71（3-4）：259-265.

［4］Catalano V，Loupakis F，Graziano F，et al.Mucinous histology predicts for poor response rate and overall survival of patients with colorectal cancer and treated with first-line oxaliplatin-and/or irinotecan-based chemotherapy［J］.Br J Cancer，2009，100（6）：881-887.

［5］Song W，Wu SJ，He YL，et al.Clinicopathologic features and survival of patients with colorectal mucinous，signet-ring cell or non-mucinous adenocarcinoma：experience at an institution in southern China［J］.Chin Med J，2009，122（13）：1486-1491.