與人巨細(xì)胞病毒UL130編碼蛋白相互作用蛋白的篩選

任高偉，崔鑫，齊瑩，馬艷萍，阮強，孫崢嶸

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院病毒研究室，沈陽 1 1 0 0 0 4）

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）在免疫功能低下的個體如HIV、器官移植患者其感染通常是致命性的［1］。

近年來的研究表明，HCMV UL/b’區(qū)相鄰的UL131A-128基因具有編碼蛋白的功能。在HCMV的感染過程中，UL131A-128基因參與病毒在體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)制、白細(xì)胞之間的播散以及樹突狀細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)［2］，而UL130作為該座位點中最大的基因，其不僅是唯一沒有內(nèi)含子的基因，而且為晚期表達(dá)基因［3］，其編碼的蛋白是一種在感染的細(xì)胞中無效分泌的腔隙糖蛋白，但卻可以以一種成熟的高爾基復(fù)合體形式整合到病毒的外膜［4］，而且pUL130是病毒感染內(nèi)皮和上皮細(xì)胞過程中一種重要的糖蛋白之一［5］。

病毒在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及病毒從內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到白細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的病毒播散過程，可能是HCMV感染致病機制的關(guān)鍵。因此，很有必要運用分子生物學(xué)實驗方法研究UL130基因編碼蛋白的生物學(xué)功能，這對揭示HCMV感染的致病機制十分重要。

本研究應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)從人胎腦cDNA文庫中篩選出與人巨細(xì)胞病毒UL130基因編碼蛋白相互作用的蛋白。最終從蛋白水平探討HCMV先天感染的致病機制，為揭示HCMV先天感染致病機制、解決人巨細(xì)胞病毒先天感染的防治、減少先天畸形兒出生等醫(yī)學(xué)問題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)本來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒室保存的臨床低傳代HCMV分離株H（傳代<5次）。HCMV分離株H UL/b’基因序列已被GenBank收錄，序列號為：GQ981646。酵母雙雜交系統(tǒng)Match－maker GAL Two-Hybrid System購自Clontech公司；MatchermakerTM cDNA Libraries人胎腦cDNA文庫由武漢大學(xué)生命科學(xué)院肖庚富教授惠贈。篩選所用相關(guān)試劑購自Sigma公司；BECKMAN臺式低溫高速離心機；Perkin Elmer PCR循環(huán)儀；電穿孔儀（Bio－Rad）；引物合成及測序由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 酵母表達(dá)重組質(zhì)粒pGBKT7-UL130的構(gòu)建：依據(jù)HCMV低傳代分離株、組織及尿標(biāo)本的DNA提取方法，從HCMV分離株H中提取DNA，并以此作為HCMV UL130基因擴增模板。按照HCMV分離株 HUL/b’基因序列（序列號為：GQ981646），應(yīng)用引物設(shè)計軟件Oligo 6.0設(shè)計用于擴增HCMV UL130全序列的引物，并根據(jù)載體pGBKT7的多克隆位點序列，分別加入了EcoRⅠ及BamHⅠ識別位點（下劃線）以及保護性堿基。引物序列如下：上游引物：5′CCGGAATTCTTGTCGACCCTGCGGCTTCT GCTTCGTCAC 3′；下游引物：5′CGCGGATCCGGTACCTCAAACGATGAGATTGGGATG 3′。

應(yīng)用PCR技術(shù)以HCMV DNA為模板擴增出UL130基因的序列。反應(yīng)體系為50 μl，PCR條件為：94℃變性45 s，50℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共30個循環(huán)。將UL130擴增產(chǎn)物純化后用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，與同樣雙酶切的載體pGBKT7純化后，在T4 DNA連接酶的作用下連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中，轉(zhuǎn)化后的TG1接種于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃溫箱過夜。利用PCR方法擴增菌落，電泳觀察篩選出陽性結(jié)果，挑取陽性克隆，經(jīng)含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，菌液測序驗證克隆結(jié)果。

1.2.2 應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選人胎腦cDNA文庫中與HCMV UL130編碼蛋白相互作用的蛋白：（1）將以pACT2（含轉(zhuǎn)錄激活域）為酵母表達(dá)載體的人胎腦cDNA文庫增殖，采用堿裂解法提取文庫質(zhì)粒。（2）將重組質(zhì)粒pGBKT7-UL130轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中，然后再將提取的文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有pGBKT7-UL130的酵母細(xì)胞AH109中，轉(zhuǎn)化后的菌液分別涂二缺（亮氨酸/色氨酸缺陷，-Leu/-Trp）、四缺平板（腺嘌呤/組氨酸/亮氨酸/色氨酸，-Ade/-His/-Leu/-Trp）。在二缺平板觀察轉(zhuǎn)化效率，四缺平板上長出的克隆參照酵母雙雜交系統(tǒng)操作說明做顯色反應(yīng)。（3）將顯藍(lán)色的酵母克隆增值并用玻璃珠法提取酵母質(zhì)粒后，應(yīng)用電穿孔轉(zhuǎn)化方法將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，在含氨芐青霉素的平板篩選出陽性克隆。（4）采用PCR方法剔除重復(fù)克隆，提取大腸桿菌中的文庫質(zhì)粒并將其回轉(zhuǎn)到含重組質(zhì)粒pGBKT7-UL130的酵母菌中觀察其在二缺及四缺缺陷培養(yǎng)基上的生長結(jié)果。計算其轉(zhuǎn)化效率，計算公式為 cfu×total suspension vol（μl）/Volplated（μl）×dilution factor×μg DNA used。將與 HCMV-UL130相互作用的人胎腦cDNA文庫基因測序，利用Gen Bank的數(shù)據(jù)庫資源，運用BLAST應(yīng)用程序分析測序結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pGBKT7-UL130的成功構(gòu)建及鑒定

采用特異性引物擴增HCMVUL130基因片段，其片段長度為645 bp，將HCMVUL130片段成功克隆到酵母表達(dá)載體pGBKT7上（圖1），并命名為pGBKT7-UL130。pGBKT7-UL130克隆的鑒定采用pGBKT7質(zhì)粒兩端的上、下游引物，應(yīng)用PCR技術(shù)鑒定含pGBKT7-UL130質(zhì)粒的陽性克隆，測序分析顯示結(jié)果與預(yù)期一致（圖2）。

2.2 將重組質(zhì)粒pGBKT7-UL130成功轉(zhuǎn)化到酵母菌AH109中

用小劑量醋酸鋰法將重組質(zhì)粒pGBKT7-UL130轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 AH109中，在色氨酸缺陷（SD/-Trp）的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，由于酵母細(xì)胞AH109株為SD/-Trp，而以pGBKT7為表達(dá)載體的誘餌蛋白可以誘導(dǎo)酵母細(xì)胞AH109產(chǎn)生Trp，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化pGBKT7-UL130的酵母細(xì)胞AH109在SD/-Trp的培養(yǎng)基上成功生長。

2.3 將人胎腦cDNA文庫成功轉(zhuǎn)入含有重組質(zhì)粒pGBKT7-UL130的酵母菌AH109中

利用大劑量醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法將人胎腦cDNA文庫轉(zhuǎn)入含有重組質(zhì)粒pGBKT7-UL130的酵母菌AH109中，轉(zhuǎn)化后分別鋪板于SD/-Trp/-Leu，SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His兩種營養(yǎng)缺陷的培養(yǎng)基中，30℃溫箱中孵育5 d后，在15個四缺培養(yǎng)基中觀察到有15個酵母菌落生長，通過二缺培養(yǎng)基中的菌落數(shù)大約300左右，轉(zhuǎn)化效率0.15×104cfu/μg，轉(zhuǎn)化效率略低，為了避免文庫信息丟失故而進(jìn)行了多次篩選。

2.4 鑒定篩選出的陽性克隆質(zhì)粒

篩選的陽性克隆通過增值菌落后觀察及顯色反應(yīng)排除假陽性結(jié)果后將剩余的9個克隆提取質(zhì)粒，并通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞TG1中。在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37℃溫箱過夜培養(yǎng)。在每個LB固體培養(yǎng)基中隨機選取5個克隆，應(yīng)用PCR技術(shù)，以文庫質(zhì)粒載體pACT-2的引物進(jìn)行擴增，觀察到隨機選取的5個克隆，其插入的片段大小不等（圖3）。

2.5 陽性文庫質(zhì)?；剞D(zhuǎn)入含重組質(zhì)粒pGBKT7-UL130的酵母菌AH109中進(jìn)行再次驗證及測序分析結(jié)果

將陽性文庫質(zhì)?；剞D(zhuǎn)入含重組質(zhì)粒pGBKT7-UL130的酵母細(xì)胞AH109后，在二缺和四缺培養(yǎng)基中均生長，測序結(jié)果及BLAST分析結(jié)果見表1。

表1 陽性克隆與G e n e b a n k同源序列比較F i g.1 C o mp a r i s o n o f t h e s e q u e n c e o f p o s i t i u e c l o n e s a n d h o mo l o g o u s g e n e s f r o mG e n e b a n k

3 討論

酵母雙雜交是一種在細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)的相互作用的技術(shù)，無需分離純化蛋白質(zhì)，是實現(xiàn)大規(guī)模高通量分析的主要方法。真核轉(zhuǎn)錄因子含有兩個相對獨立的功能域：DNA結(jié)合域（DNA binding domain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（activation domain，AD）。當(dāng)兩者相互接近，即可激活轉(zhuǎn)錄。酵母雙雜交技術(shù)即利用上述特性，將兩個重組體在同一酵母細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生的融和蛋白分別稱之為誘餌和獵物蛋白。如果蛋白質(zhì)X和Y之間存在相互作用，則BD和AD被拉近，轉(zhuǎn)錄活性恢復(fù)，即可激活下游報告基因的表達(dá)。因此，應(yīng)用酵母雙雜交，可以分析已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用，確定發(fā)生相互作用所必需的功能域；也可以從已知蛋白質(zhì)出發(fā)，探索和該蛋白質(zhì)存在相互作用的未知蛋白質(zhì)。本研究通過構(gòu)建轉(zhuǎn)錄結(jié)合域重組質(zhì)粒pGBKT7-UL130，并將其對構(gòu)建于轉(zhuǎn)錄激活域的酵母人胎腦細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行雙雜交篩選，最終得到了15個陽性克隆并進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)9個克隆基因編碼的蛋白與7種蛋白的部分序列高度同源。

HCMV感染可引起患兒的神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)的多種疾病，已成為引起新生兒疾病和先天畸形的重要感染因素之一，本實驗初步結(jié)果表明，UL130能與突觸小體相關(guān)蛋白相互作用。SNAP在突觸小體的對接和融合過程中起到重要的作用并參與細(xì)胞內(nèi)蛋白的運輸，神經(jīng)遞質(zhì)的分泌和胞吐過程。

突觸蛋白（synapsins）是一組與突觸小泡相關(guān)的具有神經(jīng)元特異性的磷酸蛋白，幾乎分布于所有的神經(jīng)終末處，并位于突觸前膜的表面。突觸小泡膜蛋白（snapin）［6］通過直接結(jié)合突觸小體相關(guān)蛋白（SNAP of 25 kDa，SNAP25）而與可溶的 N-己基順丁烯二酰亞胺敏感因子吸附蛋白受體（SNARE）的核心復(fù)合體相連，從而調(diào)節(jié)（促進(jìn)）SNARE核心復(fù)合體與突觸結(jié)合蛋白（synaptotagmin）的相互作用。將外源性重組snapin羧基端肽段注入突觸前神經(jīng)元胞體抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，通過競爭性抑制內(nèi)源性snapin與SNARE核心復(fù)合體的結(jié)合，從而削弱了synaptotagmin與SNARE核心復(fù)合體的相互作用。進(jìn)一步對snapin的研究發(fā)現(xiàn)［7］，snapin經(jīng)PKA磷酸化后與SNAP25的結(jié)合顯著增加，而且PKA磷酸化的snapin可增強synaptotagmin與SNARE核心復(fù)合體的結(jié)合，從而促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

突觸膜糖蛋白（synaptophysin，p38）是突觸小泡膜的特異性組成蛋白［8］，在中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中均有表達(dá)，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、疾病、損傷和再生等的研究中具有重要意義。p38是位于突觸小泡膜上的糖蛋白，Thomas等［9］發(fā)現(xiàn)p38的跨膜結(jié)構(gòu)、電導(dǎo)值范圍與通道蛋白相一致，與通道蛋白具有共同的功能特征，即p38可能構(gòu)成突觸小泡的特異性膜通道，可轉(zhuǎn)運低分子復(fù)合物，允許胞質(zhì)和小泡內(nèi)部之間進(jìn)行物質(zhì)交換。p38與Ca2+結(jié)合后誘導(dǎo)小泡膜去極化，啟動小泡膜與突觸前膜連接，與突觸前膜上的一種通道蛋白形成間隙連接樣的孔道結(jié)構(gòu)，使神經(jīng)遞質(zhì)由小泡釋放至突觸間隙，即p38參與突觸小泡膜與突觸前膜的融合和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［ 7，8］。

HCMV UL130與snapin之間的關(guān)系，目前未見文獻(xiàn)報道。我們通過研究發(fā)現(xiàn)，HCMV UL130與snapin之間存在相互作用的關(guān)系，故而推測因人巨細(xì)胞病毒感染引起的嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病時HCMV UL130編碼的蛋白可能會影響到snapin相關(guān)蛋白發(fā)揮正常作用而引起臨床癥狀。我們所做的研究可能為從蛋白水平探討HCMV先天感染的致病機制提供有價值的線索。

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