吲哚美辛、組胺-吲哚美辛對鼠Lewis肺癌凋亡誘導(dǎo)作用的實(shí)驗(yàn)研究

王東，張彩霞

（中國醫(yī)科大學(xué) 盛京醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，沈陽 110004）

原發(fā)性支氣管肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一。肺腺癌在原發(fā)性支氣管肺癌中極為常見，傳統(tǒng)化療和放療對肺腺癌效果均不甚理想［1］，而且其創(chuàng)傷大、不良反應(yīng)多、患者耐受力差及經(jīng)濟(jì)等問題都極大限制了其臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過吲哚美辛（indomethacin，IN）、 組 胺 -吲 哚 美 辛（histamin-indomethacin，his-IN）對Lewis肺癌荷瘤小鼠治療的研究，探討其在抗腫瘤方面的作用。

1 材料與方法

1.1 動物

鼠Lewis肺癌瘤株引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。昆明小鼠鼠齡6～8周，體質(zhì)量（20±2）g，雄性，購于中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。二甲基亞砜（DMSO）購自沈陽市化工二廠。

1.2 主要試劑及儀器

IN由山西云鵬藥業(yè)藥廠提供，純度98.5%；his-IN純度＞95%，為本研究組委托沈陽藥科大學(xué)協(xié)助合成；TNF-α放射免疫分析藥盒購于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司；SE型Facsvantage流式細(xì)胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）美國 Becton Dickinson公司產(chǎn)品，由中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院中心試驗(yàn)室提供。

1.3 鼠Lewis肺癌模型制備及分組

將Lewis肺癌荷瘤模型鼠處死，取生長良好的腫瘤組織5 g用研磨器磨碎，加生理鹽水15 ml稀釋成細(xì)胞懸液。用注射器接種每只0.2 ml細(xì)胞懸液，接種于30只昆明小鼠右前肢腋部皮下，待腫瘤長徑達(dá)1.0 cm左右，將30只Lewis肺癌荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組，每組均為6只，生理鹽水對照組，IN分為3.0 mg/kg及3.5 mg/kg治療組，his-IN分為3.0 mg/kg及3.5 mg/kg治療組，均采用灌胃法，隔日按劑量給藥，連續(xù)觀察10 d。

1.4 IN抑瘤實(shí)驗(yàn)

每次給藥前用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑（a）、短徑（b），并按公式V＝1/2·ab2計算腫瘤體積。分別取鼠血1 ml，離心后留血清置于-20℃冰箱中保存。灌胃10 d治療結(jié)束后以頸椎脫位法處死小鼠，取出完整腫瘤組織稱重。按體積法計算各組抑瘤率：抑瘤率（%）＝（1-實(shí)驗(yàn)組平均體積/對照組平均體積）×100。

1.5 FCM檢測細(xì)胞凋亡峰及凋亡率

各組治療后分別處死Lewis肺癌荷瘤小鼠，取瘤組織、稱質(zhì)量，生理鹽水沖洗；于200目不銹鋼濾網(wǎng)上加2 ml生理鹽水研磨，形成單細(xì)胞懸液，待測細(xì)胞濃度為（5×105～5×106）/ml；取 1 ml細(xì)胞，1 000 r/min，4 ℃離心 10 min，棄上清；加入 1 ml冷 PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清（重復(fù)2次）；將細(xì)胞重懸于200 μl Binding Buffer，；加入 10 μl Annexin Ⅴ-FITC 和 10 μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min或4℃反應(yīng)30 min；加入300 μl Binding Buffer，在1 h內(nèi)上機(jī)檢測。FCM用碘化丙錠（PI）染色后分析，可在二倍體G0/G1，峰前出現(xiàn)“亞二倍體”峰，即細(xì)胞凋亡峰（APO峰），根據(jù)APO峰可測出凋亡細(xì)胞百分率［2］，其熒光信號經(jīng)流式細(xì)胞儀Multicycle細(xì)胞周期分析軟件處理后以直方圖和數(shù)據(jù)表方式在熒光屏上顯示。

1.6 放免法測定TNF-α含量

將事先放在-20℃冰箱中保存的血清取出，與125I-TNF-α放射免疫分析藥盒中提供的校準(zhǔn)品依次加入試管中，標(biāo)記物、抗體等試劑按程序規(guī)定分別加入對應(yīng)的試管中，充分混勻，放置于4℃冰箱中24 h后，加入分離劑、充分混勻、室溫放置15 min，離心前任取兩管測量總放射性T，3 500 r/min離心20 min，棄上清液，測量各管放射性計數(shù)。在logit-Log坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品B/B0%，依標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品的含量。1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 抑瘤率

his-IN及IN治療各組與對照組Lewis肺癌荷瘤小鼠在治療過程中腫瘤體積變化，見圖1。治療各組腫瘤體積增長緩慢，治療10 d后各治療組的抑瘤率與對照組比較，腫瘤生長均受到明顯抑制（P＜0.05），各治療組的抑瘤率分別為IN 3.0 mg/kg組38.56%、IN 3.5 mg/kg組52.25%、his-IN 3.0 mg/kg組57.62%和his-IN 3.5 mg/kg組79.21%，各治療組均有不同程度抑制Lewis肺癌的生長，治療組與對照組瘤重有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 FCM檢測細(xì)胞凋亡峰及凋亡率

AnnexinⅤ-FITC加PI雙標(biāo)法發(fā)現(xiàn)：在雙變量FCM的散點(diǎn)圖上可以看出，不同治療組的Lewis肺癌荷瘤小鼠右下象限（FITC+/PI-）可見大量細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，尤以3.5 mg/kg his-IN組明顯，如圖2所示；不同治療組與對照組的凋亡率（%）詳見表1。PI單標(biāo)法行流式細(xì)胞儀檢測不同治療組均可在G0/G1峰期前出現(xiàn)明顯的“亞二倍體峰”，即APO峰，而生理鹽水對照治療組未見明顯凋亡峰；his-IN組或IN組隨劑量的增加，凋亡峰出現(xiàn)更明顯，其中3.5 mg/kg his-IN組凋亡峰出現(xiàn)最明顯，見圖3。

2.3 放免法測定

各組Lewis肺癌荷瘤小鼠的血清中TNF-α的含量在治療前基本相近，治療后TNF-α的含量均升高，給藥治療10 d后TNF-α含量詳見表1。治療后各組TNF-α的含量與生理鹽水對照組均有顯著性差異（P<0.05）。

表1 不同治療組的細(xì)胞凋亡率和TNF-α的含量比較（±s）Tab.1 Comparison of the apoptosis rate and TNF-α content in different groups（±s）

表1 不同治療組的細(xì)胞凋亡率和TNF-α的含量比較（±s）Tab.1 Comparison of the apoptosis rate and TNF-α content in different groups（±s）

Content of TNF-α Before treatment After treatment Control 6 10.30±3.45 0.58±0.26 0.71±0.24 3.0 mg/kg IN 6 29.58±2.53 0.61±0.29 1.03±0.36 3.5 mg/kg IN 6 42.41±1.94 0.65±0.31 1.35±0.42 3.0 mg/kg his-IN 6 41.24±1.86 0.62±0.25 1.39±0.44 3.5 mg/kg his-IN 6 51.69±0.68 0.59±0.27 2.11±1.13 Group n Apoptosis rate（%）

3 討論

對腫瘤發(fā)病機(jī)制和治療藥物的研究是一項(xiàng)重要的科學(xué)探索課題。腫瘤細(xì)胞的惡性增生和轉(zhuǎn)移是破壞機(jī)體完整性的原因之一，而癌癥的化療和放療都是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡得以實(shí)現(xiàn)的［3］。因此，腫瘤細(xì)胞凋亡的檢測特別是在活體動物體內(nèi)的檢測成為目前國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)［4］。

細(xì)胞凋亡［5］作為細(xì)胞死亡的主要形式，可清除機(jī)體受損細(xì)胞，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。細(xì)胞凋亡是一種由多基因調(diào)控的細(xì)胞自主的死亡過程，又稱程序性死亡，是一種受控于基因指導(dǎo)的主動性細(xì)胞自我消亡過程，是細(xì)胞固有的功能，其形態(tài)特征包括細(xì)胞固縮、染色質(zhì)凝聚邊集至核膜下以及凋亡小體形成［6］。當(dāng)前普遍認(rèn)為各種化療藥物無論藥物的靶點(diǎn)在哪，最終主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死而達(dá)到治療目的［7］。如何提高腫瘤細(xì)胞凋亡率、降低增殖速度、防止殺傷正常組織，是腫瘤治療的方向。臨床上可將腫瘤細(xì)胞凋亡作為評估化療效果的一項(xiàng)指標(biāo)。Wei等［8］給昆明鼠接種H22肝癌細(xì)胞，每日喂服IN，21 d后用流式細(xì)胞儀檢測，H22細(xì)胞出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰。通過流式細(xì)胞儀對胃癌凋亡峰的測定，可見典型的亞二倍體凋亡峰。Zhang等［9］將IN加入化療藥物足葉乙甙（Vp-16）中共同作用于慢性髓細(xì)胞白血病（CML），發(fā)現(xiàn)IN可發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，提高Vp-16的誘導(dǎo)凋亡作用。

腫瘤壞死因子是一個多功能細(xì)胞因子，由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，為一種多功能蛋白，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝及誘導(dǎo)細(xì)胞分化，它對腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用，在體內(nèi)可通過對腫瘤血管的促凝作用，而使腫瘤缺血壞死。近期有研究證明，TNF-α可抑制某些腫瘤細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［10］，IN與化療同時應(yīng)用，治療后血清TNF-α水平升高，可直接殺傷腫瘤細(xì)胞［11］。IN具有調(diào)整機(jī)體免疫狀態(tài)，刺激機(jī)體產(chǎn)生TNF、IL-2和INF等因子，因而具有直接抗腫瘤和輔助抗腫瘤作用［12］，能協(xié)同提高TNF和IL-2抗腫瘤療效。TNF-α與肺癌的預(yù)后和復(fù)發(fā)有關(guān)，血中TNF-α含量可反映機(jī)體抗腫瘤免疫狀態(tài)，TNF-α水平升高可能有益于調(diào)動自身抗癌能力［13］。流式細(xì)胞術(shù)還可以通過測定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）在細(xì)胞凋亡時轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜外表面來檢測細(xì)胞凋亡。膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高度親和力，熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V與細(xì)胞表面PS結(jié)合，再用FCM進(jìn)行檢測，可以觀察凋亡過程中細(xì)胞膜PS的表面化，結(jié)合PI染色進(jìn)行雙參數(shù)檢測可區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞［13］。檢測發(fā)現(xiàn)：不同治療組的凋亡率分別為3.0 mg/kg his-IN 組凋亡率為（41.24±1.86）%；3.5 mg/kg his-IN 組凋亡率為（51.69±0.68）%；3.0 mg/kg IN組凋亡率為（29.58±2.53）%；3.5 mg/kg組凋亡率約為（42.41±1.94）%，生理鹽水對照組凋亡率約為10.3%；不同治療組均可在G0/G1峰期前出現(xiàn)明顯的“亞二倍體峰”及APO峰，而用生理鹽水對照組未見確切的凋亡峰；his-IN組及IN組隨劑量的增加，凋亡峰明顯，其中3.5 mg/kg組凋亡峰最明顯，其結(jié)果表明：his-IN及IN均有明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其中3.5 mg/kg his-IN組最高。結(jié)果顯示IN和his-IN可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，來發(fā)揮抗腫瘤的作用。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用放免方法測得各治療組TNF-α的含量：獲得荷瘤鼠IN組與his-IN組不同劑量治療組的血清TNF-α的含量較治療前均明顯升高；尤其高劑量his-IN組TNF-α含量較其低劑量組明顯升高，IN高劑量治療組TNF-α含量高于低劑量治療組，可見TNF-α含量呈劑量依賴型；3.5 mg/kg his-IN組與其他各治療組相比TNF-α含量有顯著性差異（P＜0.05），可見his-IN也可能是通過促進(jìn)TNF-α的釋放來間接發(fā)揮抗腫瘤作用。另外，本試驗(yàn)通過每日對荷瘤鼠腫瘤的體積及質(zhì)量的測量可見：不同治療組的腫瘤體積及質(zhì)量都較治療前明顯縮小，抑瘤率都明顯提高；3.5 mg/kg his-IN組的抑瘤率最為顯著，與其他治療組比較亦有顯著性差異（P＜0.05）；3.0mg/kg his-IN組與3.5 mg/kg IN組抑瘤率基本接近，無顯著性差異（P＞0.05）。提示his-IN及IN對腫瘤可產(chǎn)生直接抑制作用，且高劑量的his-IN組抑瘤效果更明顯。

本研究國內(nèi)外首次合成his-IN，并將其用于動物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)his-IN、IN有明顯地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，尤其his-IN的高劑量更為明顯，his-IN、IN的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，為臨床腫瘤的治療提供了更重要的理論基礎(chǔ)。

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