人結腸癌細胞株CW-2干細胞生物學特性研究

劉美，艾亮，陳宓，龍浩，李少林

（重慶醫科大學 基礎醫學院放射醫學教研室，重慶 400016）

癌干細胞理論認為，結腸癌發生、復發、轉移、耐藥的根源是腫瘤內部一小部分具有自我更新、多向分化潛能的細胞，即癌干細胞（cancer stem cell，CSC）［1，2］分離并對結腸癌干細胞生物學特性的研究對結腸癌的診斷、治療具有十分重要的意義。本實驗應用無血清懸浮培養+奧沙利鉑+流式細胞分選技術（多重聯合法）逐步分離純化人結腸癌細胞株CW-2干細胞，并對其生物學特性進行研究［3～6］。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌細胞株CW-2購自中國科學院上海生命科學院細胞庫；RPMI 1640和DMEM/F12培養基購自Hyclone公司；胰酶購自Gibco公司；重組人表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）、重組人白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、重組人堿性成纖維生長因子（fibroblast growth factor-basic，bFGF）購自 Sinobio 公司；青霉素 G、鏈霉素購自華北制藥股份有限公司；奧沙利鉑購自深圳海王藥業有限公司；Anti-CD44-FITC、Anti-Ep－CAM-PerCP-Cy5.5和其同型抗體購自BD Bioscience公司；Transwell小室購自Costar公司；24孔板購自Corning公司；Matrigel膠購自BD Bioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 CW-2細胞在傳統含血清培養基（serum-supplemented medium，SSM）中常規培養。

1.2.2 無血清懸浮培養+奧沙利鉑富集結腸癌CW-2干細胞：

將SSM中處于對數增長期的細胞以105/ml接種于由 DF12（DMEM/F12）、EGF（20 ng/m1）、bFGF（10 ng/m1）、LIF（10 ng/m1）組成的無血清培養基（serum-free medium，SFM）中傳代培養。另培養基中添加青霉素 G（l00 U/ml）、鏈霉素（100 U/ml）和奧沙利鉑（1 μg/m1）。藥物處理24 h后800 r/min離心5 min去除化療藥物奧沙利鉑，重新加入無血清培養液，繼續培養。前2周直接向培養瓶中加入培養液。2周后通過胰酶消化法和機械吹打法分離成單細胞懸液后傳代。每日觀察CW-2細胞在SFM中形成腫瘤干細胞球的過程。

1.2.3 流式細胞儀分選：

將SFM+奧沙利鉑處理14 d后細胞球消化、離心、PBS清洗、熒光抗體標記后在FACS上分選出CD44+EpCAM+和 CD44－EpCAM－細胞。

1.2.4 流式細胞檢測CD44、EpCAM的表達：

流式細胞儀分選后CD44+EpCAM+細胞上流式細胞儀分析檢測CD44+EpCAM+細胞比例。

1.2.5 細胞周期檢測：

收集 FACS 分選后 CD44+EpCAM+和 CD44－Ep－CAM－細胞懸液，上流式細胞儀進行細胞周期檢測。

1.2.6 動物致瘤實驗：

4～5周齡NOD/SCID三聯免疫缺陷小鼠由重慶醫科大學實驗動物中心提供，性別不限。隨機分成SSM 組、CD44+EpCAM+細胞組、CD44－EpCAM－細胞組，將SSM培養細胞、多重聯合分選后CD44+Ep－CAM+細胞、CD44－EpCAM－細胞收集后調為所需濃度，按1∶1比例與Matrigel混合，均以104個細胞數量接種NOD-SCID小鼠右肩部皮下。每周2次觀察腫瘤生長狀況，測量并記錄第 4，7，14，21，28 d 腫瘤的體積。

1.2.7 Transwell侵襲實驗：

將 10 mg/ml的 Matrigel膠與 RPMI 1640培養液按1∶5的比例混合，每孔取60 μl混合液均勻鋪與Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜上制成人工基底膜。37℃溫育30 min使膠固化。下室內加入600 μl趨化因子（3T 3上清液）：胎牛血清培養液比例為1∶1的混合培養液，上室內分別加入500 μl血清懸浮培養細胞+SSM、CD44+EpCAM+細胞+SFM，CD44－EpCAM－細胞+SSM，各組細胞密度均為 3×105/ml，每組設6個相同的孔。在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。72 h后×200倒置顯微鏡下觀察下室內細胞，計數每個×200鏡視野下細胞的數量，每下室記3個視野后取平均值。

1.3 統計學分析

運用SPSS 11.0統計分析軟件進行多重測量設計資料的方差分析、完全隨機設計資料的方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞學檢測

多重聯合分選后雙陽性細胞中CD44+EpCAM+癌干細胞含量為89.57%。

2.2 細胞周期檢測

CD44+EpCAM+細胞處于低增殖狀態，G0/G1期細胞占86.19%，G2+S期細胞占13.81%，而CD44－Ep－CAM－細胞相對處于高增殖狀態，G0/G1期細胞占56.04%，G2+S細胞占43.96%（圖 1）。

2.3 體外侵襲實驗

多重聯合分選后CD44+EpCAM+細胞組、SSM組和CD44－EpCAM－細胞組下室細胞均數分別為188個/視野、56個/視野、0個/視野。各組間差異有統計學意義（P＜0.05）。結果提示，多重聯合分選后CD44+EpCAM+癌干細胞的侵襲能力大于單純SSM培養細胞和 CD44－EpCAM－細胞（圖 2）。

2.4 體內成瘤實驗

CD44＋EpCAM＋細胞組 4 d 可觸及腫瘤，SSM 組14 d才可觸及腫瘤，而CD44－EpCAM－細胞組始終無腫瘤生長。測量并記錄 4 d、7 d、14 d、21 d、28 d 腫瘤的體積。各組間差異有顯著統計學意義（P＜0.05）。可見多重聯合分選后的CD44+EpCAM+細胞的成瘤能力明顯強于SSM培養細胞和CD44－EpCAM－細胞（圖 3）。

3 討論

腫瘤干細胞分選方法的選擇是獲得癌干細胞的關鍵。提高癌干細胞的純度是目前國內外學者們研究的重點。本實驗以結腸癌細胞株CW-2為研究對象，將無血清懸浮培養法、化療藥物法、流式細胞分選法聯合起來逐步分離出了純度高達89.57%的CD44+EpCAM+癌干細胞，獲得了較以往［3，7］純度更高的癌干細胞。

同時本實驗在獲得純度相對較高癌干細胞的基礎上，還通過細胞周期檢測、體外侵襲實驗、體內成瘤實驗［8］對 CD44＋EpCAM＋癌干細胞進行生物學特性研究。研究發現CD44＋EpCAM＋癌干細胞具有比普通細胞和非癌干細胞更強的成瘤能力、侵襲能力和增殖能力。

研究結果表明，CD44＋EpCAM＋癌干細胞是一群具有高致瘤性、高侵襲性、低增殖性細胞。通過本實驗我們不但提高了所得癌干細胞的純度，還進一步深化了癌干細胞的生物學特性研究。為癌干細胞理論研究和臨床實踐奠定了堅實的基礎，為腫瘤的治療開辟了新的道路。

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