dBcAMP通過上皮生長因子受體間接激活誘導星形膠質細胞形態變化

李紅梅，楊曉臨，彭亮

（中國醫科大學 藥學院臨床藥理學教研室，沈陽 110001）

星形膠質細胞是哺乳動物腦內分布最廣泛的一類細胞，也是膠質細胞中體積最大的一種，約占腦細胞容量的40%。研究表明，膠質細胞在腦組織損傷或缺血時發生激活現象，表現為細胞體積變大、數量增多和膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達增加等一系列形態和功能的變化［1］。了解星形膠質細胞分化的調節機制至關重要。研究表明，提高細胞內環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）濃度能夠誘導星形膠質細胞的形態變化，因此常用作星形膠質細胞形態分化的研究模型［1］。本研究應用免疫細胞化學技術觀察了細胞膜滲透型的cAMP類似物雙丁酰環腺苷酸（dibutyryl cyclic adenosine monophosphate，dBcAMP）誘導的星形膠質細胞形態變化，并進一步探討其信號傳導通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：馬血清購自GIBCO公司；DMEM培養基、dBcAMP和Anti-GFAP購自Sigma公司；GM6001和AG1478購自Calbiochem公司；羊抗兔IgG-FITC購自Santa Cruz公司。

1.1.2 動物：CD-1小鼠，雌、雄兩性，體質量30～40 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代星形膠質細胞培養及分組：星形膠質細胞取材于新生CD-1小鼠大腦皮質。無菌操作，斷頭剝離腦膜后，取出腦組織。顯微鏡（SZ6045 OLYMPUS，日本）下分離出大腦皮質，將其切碎至1 mm3以下組織塊移入離心管中，渦旋器上充分振蕩1 min，分別過100 μm和70 μm濾膜。將細胞混懸液種植在含有蓋玻片的培養皿中，37℃、5%CO2培養箱中孵育。通常1個小鼠大腦可以鋪10個35 mm培養皿。使用含有7.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基（8.3 g/L DMEM，2.0 mmol/L L-Glutamine，7.5 mmol/L葡萄糖，1.25 mmol/L丙酮酸鈉，44 mmol/L碳酸氫鈉，0.042 mmol/L酚紅），初始為含20%馬血清的DMEM培養基，每3 d更換1次新鮮培養基，第3次更換的培養基馬血清濃度降為10%，培養2周。將原代培養2周的細胞分為6組，并分別孵育72 h：（1）dBcAMP 組：加入 0.25 mmol/L dBcAMP；（2）dB－cAMP+AG1478組：1 μmol/L上皮生長因子受體（epidermal growth factor recepter，EGFR）特異性拮抗劑AG1478刺激15 min后，再加入0.25 mmol/L dB－cAMP，獨立的實驗重復 2 次；（3）dBcAMP+GM6001組：加入10 μmol/L金屬蛋白酶組織抑制劑GM6001 15 min后，再加入0.25 mmol/L dBcAMP，獨立的實驗重復 2 次；（4）AG1478 組：加入 1 μmol/L AG1478；（5）GM6001 組：加入 10 μmol/L GM6001；（6） 對照組：未加任何處理因素。

1.2.2 免疫細胞化學技術：用冷PBS（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO3·12H2O，2 mmol/L KH2PO3，1 mmol/L CaCl2，0.5 mmol/L MgCl2和7.5 mmol/L glucose，pH 7.4）輕輕沖洗細胞后，加入純甲醇-20℃固定6 min。再用PBS沖洗細胞，加入含山羊血清的0.3%Triton X-100 PBS溶液封閉30 min后，加入GFAP特異性抗體（1∶100稀釋），4℃過夜，PBS沖洗3次，每次10 min。然后加入羊抗兔IgG-FITC（1∶100稀釋）孵育 2 h，4℃避光，PBS沖洗3次，每次10 min。50%甘油封片后熒光顯微鏡（BX51 OLYMPUS，日本）觀察。

2 結果

2.1 dBcAMP誘導星形膠質細胞發生形態變化

通過免疫熒光鑒定星形膠質細胞，顯微鏡下放大400倍觀察GFAP免疫反應陽性細胞的形態。結果如圖1所示，對照組星形膠質細胞胞體較小，呈多角形，胞膜光滑，邊界清楚，突觸也較短。經0.25 mmol/L dBcAMP處理的星形膠質細胞形態發生明顯改變，胞體由多角形轉變為星形，突觸增長并相互交織成網狀。

2.2 dBcAMP通過上皮生長因子受體間接激活引起星形膠質細胞形態變化

dBcAMP+AG1478組細胞與對照組形態相似，胞體呈多角形，提示AG1478抑制了dBcAMP誘導的星形膠質細胞形態變化（圖2）。表明dBcAMP可通過上皮生長因子受體的間接激活引起此形態變化過程。

2.3 金屬蛋白酶參與dBcAMP引起的星形膠質細胞形態變化

dBcAMP+GM6001組細胞與對照組形態相似，胞體呈多角形（圖3），提示GM6001抑制了dBcAMP誘導的星形膠質細胞形態變化。表明金屬蛋白酶參與此形態變化過程。

3 討論

星形膠質細胞在腦組織損傷或缺血時可發生細胞體積變大、數量增多和GFAP表達增加等一系列形態和功能的變化［2］。反應性星形膠質細胞的增多可能是為了滿足星形膠質細胞代謝活動的增加。GFAP表達量的增加反映了星形膠質細胞的增生和發育，在神經元損傷后的修復保護中有重要意義［3］。Friedberg［4］認為星形膠質細胞的活化可以作為腦損傷的證據。因此，了解星形膠質細胞分化的調節機制至關重要。本研究應用免疫細胞化學技術觀察了dBcAMP誘導的星形膠質細胞形態變化，并進一步探討其信號傳導通路。

上皮生長因子受體廣泛存在于腦內［5］，星形膠質細胞表達該受體的ErbB1及ErbB4亞型。上皮生長因子受體間接激活是近年來發現的細胞內/外信號傳導途徑，是細胞根據外界刺激調節自身及其周圍神經元功能的一種巧妙方式，也是星形膠質細胞調節與其相鄰的神經元增生、分化、生長等效應的關鍵環節。經典的上皮生長因子受體間接激活的信號傳導途徑為［6］：Gi蛋白耦聯受體激活之后，由三合體Gi蛋白的βγ亞單位激活細胞內金屬蛋白酶，在后者的作用下上皮生長因子家族成員由細胞膜表面脫落釋放于細胞外液，與細胞自身與鄰近細胞的EGFR結合，導致其發生磷酸化，從而激活細胞內Ras蛋白激酶-絲裂原激活蛋白激酶和磷脂酰肌醇-3激酶信號傳導通路。我們早期的研究結果表明，在原代培養的星形膠質細胞，右旋美托咪啶可通過上皮生長因子受體間接激活誘導細胞外調節蛋白激酶的磷酸化［7，8］。

Haghighat等［9］的研究表明，在大鼠原代培養的星形膠質細胞和神經膠質瘤細胞，dBcAMP作用24 h后能夠引起細胞形態發生變化。本研究發現，dB－cAMP能夠引起原代培養的星形膠質細胞由多角形轉變為星形，且這種形態變化能夠被上皮生長因子受體特異性拮抗劑AG1478所抑制；同時，這種形態變化也能夠被金屬蛋白酶組織抑制劑GM6001所阻斷。本實驗結果提示，dBcAMP通過激活細胞內金屬蛋白酶，進一步導致上皮生長因子受體自身磷酸化，從而誘導星形膠質細胞的形態變化。

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