木質素過氧化物酶的研究進展

安徽農業大學動物科技學院 劉海進 李呂木＊

木質素是一類結構復雜、穩定的生物大分子物質，其產量僅次于纖維素（Zyskind和Bernstein，1991）。我國秸稈類物質資源豐富，但木質素約占其20%，由于動物體內缺乏降解木質素的酶類，因此其飼料價值較差。研究表明，通過微生物酶的降解作用，可將飼料原料中的木質素分解為可被動物吸收利用的小分子物質，從而提高其飼用價值 （陳光耀和曹兵海，2003）。木質素過氧化物酶（LiP）是木質素的生物降解過程中的主要木質素降解酶類，可在木素聚合物內形成自由基，導致鍵穩定變差從而破壞木質素大分子。本文對近年來關于LiP特性、催化機制、生產及應用等方面的研究進行了綜述。

1 木質素過氧化物酶的特性與來源

Kent和Ming等（1983）首次從白腐真菌屬的黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的限制性培養基中發現了LiP，并認為其屬于氧化還原酶，是真菌分泌的一種含鐵血紅素的糖基化細胞外蛋白過氧化物酶。研究表明，LiP的糖基化亞鐵血紅素蛋白質通常以多種復合的形式產生，即含有多種同工酶，分子質量一般在37～47 kDa，經過純化后的LiP的分子質量在40 kDa左右，等電點為3.5左右，最適酶活溫度為35～55℃，最適 pH 為2～ 5（Asgher等，2006）。 LiP氧化還原電位為1.5 V，在H2O2存在時，LiP能氧化分解芳香環多聚體，被認為是木質素降解的關鍵酶之一。

LiP主要是由微生物分泌所產生，如黃孢原毛平革菌（Phanerochete chrysosoporium）、彩絨草蓋菌（Coridusversicolor）、變色栓菌（Thametes versicolor）、 煙管菌 （Bjerkandera adusta）、 射脈菌（Phlebia radiata）、鳳尾菇（Pleurotus pulmonanus）朱紅密孔菌 （Pycnoporus cinnabarinu）等。Adhi（1989）研究發現，革蘭氏陽性菌（Streptomyces viridosporus）T7A 也可產生 LiP。

2 木質素過氧化物酶的催化機制及酶活測定

2.1 催化機制 LiP是一系列含Fe3+、卟啉環和血紅素輔基的同工酶。Tien和Kirk（1988）認為，LiP可利用H2O2及有機過氧化物催化一系列底物，其催化作用具有非特異性。Haemmerli等（1986）和Hammel等（1986）研究也發現LiP的作用底物很廣泛，主要包括酚類和非酚類芳香化合物，可以氧化木質素單體、二體、三體以及多環芳烴（如苯并芘）等底物。其降解底物的特點為：LiP能氧化富含電子的酚型或非酚型芳香化合物，在通過電子傳遞體攻擊底物時，能從苯酚或非酚類的苯環上奪取一個電子，將其氧化成自由基，繼而以鏈式反應產生許多不同的自由基，導致底物分子中主要鍵斷裂，然后發生一系列的裂解反應。具體反應機制見圖1。

圖1 木質素過氧化物酶的催化循環

LiP化合物Ⅰ攜帶H2O2的兩個氧化當量，一個為Fe4+-O中心，另一個形成卟啉的陽離子自由基。基質R被化合物Ⅰ氧化成芳基陽離子自由基，然后通過一系列的非酶反應生成最終的產物。木質素的結構單元之間主要通過醚鍵（β-O-4）和碳碳鍵（C-C）的方式連接，LiP通過催化木質素側鏈的Cα-Cβ鏈使其斷裂從而降解木質素（Hammel等，1993）。

2.2 酶活測定 LiP酶活的測定主要采用黎蘆醇氧化速率法。由于黎蘆醇是LiP作用的直接底物，根據310 nm處測得的黎蘆醇的吸光度值大小來判定LiP的酶活。具體方法為：1 mL反應液中含0.2 mL藜蘆醇溶液、0.4 mL酒石酸緩沖液（250 mmoL/L，pH 3.0）、0.4 mL 培養液或稀釋液、20 μL 20 mmoL/L H2O2溶液，于 30 ℃反應 2 min，測定310 nm的吸光度值。在空白組中，以蒸餾水代替H2O2溶液，其他反應物不變。1個酶活單位（U）的定義為每分鐘氧化黎蘆醇產生1 μmol黎蘆醛所需的酶量（Tien和 Kirk，1988）。

3 木質素過氧化物酶的生產

3.1 游離培養木質素過氧化物酶 游離培養LiP合成的主要影響因素為培養基的成分和培養條件（氧濃度）。張紅等（2005）在限碳靜置、限氮振蕩不加藜蘆醇的環境下，研究發酵條件對黃孢原毛平革菌合成LiP影響的結果顯示：限碳靜置培養時，酶活可達1193 U/L，碳源以葡萄糖0.04%和糊精0.16%同時存在比單一葡萄糖作為碳源獲得較高的酶活；限氮振蕩培養時，所得酶活可達980 U/L。畢鑫等（2003）在靜置和振蕩兩種培養條件下研究營養條件對白腐菌合成LiP影響的結果表明：靜置培養時，LiP在碳氮比低的培養基中顯示較高的酶活力，碳源以葡萄糖0.02%和糊精0.18%同時存在或分段加入要比單一葡萄糖作為碳源時獲得更高的酶活；振蕩培養時，在碳氮比高的培養基中LiP酶活最高，而類似于靜置培養的氮源組合及分段模式卻明顯抑制LiP的合成；優化后，靜置培養在第6天可獲得7560 U/L的酶活，振蕩培養在第8天獲得6500 U/L的酶活?？率朗〉龋?000）研究發現，氧濃度對固定化黃孢原毛平革菌合成過氧化物酶影響較大，空氣環境下限碳培養黃孢原毛平革菌，其合成的LiP最高活力可達360 U/L，比通純氧條件下限碳培養時高160%。

3.2 固定化培養木質素過氧化物酶 近年來，采用固定化細胞培養合成LiP已得到了廣泛的重視，與游離細胞培養相比，其能更有效地合成LiP。目前已采用多種載體對黃孢原毛平革菌的固定，其中用尼龍網、硅管、聚丙烯、不銹鋼、瓊脂糖和瓊膠顆粒等均取得了較好的效果 （Faison和Kirk，1985）。固定化后的菌絲穩定性增強并且可以重復利用。吳葉明等（2008）用大孔吸附樹脂進行黃孢原毛平革菌來源的LiP固定化試驗的結果表明，在樹脂1.0 g、酶液 pH 4.5、加酶量 87.2 U、吸附溫度25℃、吸附4 h、0.2%戊二醛、處理120 min條件下，可獲得最佳的固定化效果，固定化酶活可達到16 U/g。劉東華等（2009）通過共價結合法將LiP固定于聚氨酯泡沫上，發現固定化酶活為1.45 U/g（泡沫干重），酶活回收率達到34.79%，提高了固定化LiP的熱穩定性，且擴大了固定化LiP穩定性的pH范圍，且其重復利用性好。

3.3 利用反應器生產木質素過氧化物酶 目前，有很多關于利用生物反應器生產LiP的報道。由于LiP胞外生產的特點要求，因此除了必須滿足菌體需要的營養限制（限碳或限氮）、足夠的供氧等環境條件外，還應避免其胞外酶的結構及活性遭受剪切力等因素的破壞。與游離和固定化培養相比，生物反應器有以下幾個特點：能夠控制內部流體混和均勻、剪切力適宜；為了給細胞生長和目標產物酶的合成提供最佳的環境條件，需要能夠對反應器中的pH、溫度、溶解氧、氧化還原勢、攪拌轉速等參數進行測量和控制；必須防止雜菌污染，維持純種培養等（岑沛霖，2004）。所以利用生物反應器本身的結構和運行參數對其產酶至關重要。

目前主要使用以下幾種生物反應器來生產LiP。Couto等（2002）在機械攪拌式反應器中實現了固體培養，LiP酶活均值高達 246.8 U/L。Dominguez等（2001）采用轉鼓式生物反應器半浸沒培養黃孢原毛平革菌，LiP的酶活達364 U/L。張朝暉等（2003）在三相鼓泡塔反應器中培養黃孢原毛平革菌，在通氣量為 1.0 L/（L·min）時，LiP 酶活最高達 367 U/L。Ruggeri和 Sassi（2003）利用滴流床生物反應器間歇培養黃孢原毛平革菌，LiP酶活達1220 U/L。Shim和 Kawamoto（2002）把生長培養基和誘導培養基交替通入到8 L的固定床反應器中間歇培養合成LiP，其最高酶活為1800 U/L。而Gerin等（1997）比較了由氣體攪動的氣升式反應器、鼓泡式反應器和有螺旋槳攪動的攪拌式反應器后發現，使用氣升式反應器LiP酶活的最大值達4500 U/L。綜合上述研究可以發現，使用氣升式反應器能夠獲得更高的LiP的酶活。

4 木質素過氧化物酶的應用

4.1 在畜牧生產中 趙紅霞等（2002）利用白腐真菌降解秸稈中的木質素和纖維素，使其成為含有酶的糖類，提高了秸稈的適口性，易于消化吸收。Celeux和Lavergne（2005）利用白腐真菌的菌絲分泌的超纖維氧化酶可溶解秸稈表面的蠟質，菌絲進入秸稈內部并產生纖維素酶、半纖維素酶、內切聚糖酶、外切糖酶，從而可降解木質素和纖維素。其中機制可能為LiP和錳過氧化物酶（MnP）在分子氧的參與下，依靠自身形成的H2O2觸發啟動一系列自由基鏈反應，實現對木質素無特異性的徹底氧化，使秸稈降解成為含有酶的單糖，從而提高了秸稈的消化性。賈燕南等（2008）研究表明LiP和MnP可降解四環素，且在酶活為40 U/L時，LiP比MnP的降解能力強；對于LiP，當其酶活從15 U/L升高至40 U/L時，四環素降解率提高約15%，當酶活進一步升高至70 U/L時，降解率變化不大。

4.2 其他 LiP在降解有機污染物、生物制漿、處理污染廢水等方面還有廣泛的應用。張朝暉等（2002）研究表明，黃孢原毛平革菌所產的LiP能氧化多種多氯酚類物質，有些酚類物質常常是廣譜生物殺蟲劑或除草劑的前體。林鹿等（1996）報道，在LiP單獨使用或與其他酶的適當配合處理紙漿，使得制得的紙張具有良好的抗張強度和平滑度，這不僅提高紙張白度而且還降低了紙張的卡伯值。Gary等 （2003）研究發現LiP可以處理2，4-二溴苯酚等工業廢水，在氧化的過程中形成二聚體、三聚體和四聚體，從而消除了廢水的毒性。

5 展望

農作物秸稈木質素含量較高，難以作為有效的飼料來源。隨著對LiP的催化機制、相關基因結構、表達調控等的深入研究，采用優良菌種生產高效的木質素降解酶制劑，對秸稈等潛在飼料資源開發以及廢水、廢物處理等具有重要意義。

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