牛膝多糖對脂多糖免疫應(yīng)激仔豬血液生化指標(biāo)和白細(xì)胞分類計數(shù)的影響

武漢工業(yè)學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗室

劉玉蘭 郭廣倫 吳志鋒 洪 宇朱惠玲 侯永清 丁斌鷹

牛膝多糖（ABPS）是從中草藥牛膝中提取、分離、純化得到的一種生物活性多糖。研究表明，ABPS是一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有增強(qiáng)免疫，恢復(fù)免疫系統(tǒng)損傷的功能（Jin 等，2007；Mao 等，2005；邵樹軍等，2002；李宗鍇和李電東，1997）。本研究用大腸桿菌脂多糖（LPS）刺激仔豬建立免疫應(yīng)激模型，研究ABPS對斷奶仔豬血液生化指標(biāo)和白細(xì)胞分類計數(shù)的影響，旨在探討ABPS是否可以緩解LPS刺激導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)，為其在養(yǎng)豬生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和日糧 選用48頭（28±3）d的杜洛克×長白×大白斷奶仔豬，平均體重 （8.45±0.14）kg，按體重隨機(jī)分為4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)2頭豬。試驗期為28 d。基礎(chǔ)日糧參照NRC（1998）斷奶仔豬的營養(yǎng)需要量配制，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗設(shè)計及樣品采集 采用2×2因子設(shè)計，兩個因子分別為日糧處理和免疫應(yīng)激處理。日糧處理為對照日糧（即基礎(chǔ)日糧）或ABPS日糧（添加量為500 mg/kg）；免疫應(yīng)激處理為注射LPS或生理鹽水。在試驗第14天和第21天，每個處理組一半豬注射100 μg/kg BW的LPS（大腸桿菌血清型為 O55∶B5，Sigma 公司），另一半注射等量的生理鹽水作對照。注射后3 h，用肝素抗凝真空管從所有豬前腔靜脈采血10 mL，靜置15 min，3500 r/min離心20 min分離血漿，-80℃凍存待測；同時用EDTA K3抗凝采血管前腔靜脈采血2 mL用于白細(xì)胞分類計數(shù)。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 血液生化指標(biāo) 采用日立7020全自動生化分析儀測定血糖（GOD-PAP法）、尿素氮（酶偶聯(lián)速率法）、總蛋白（雙縮脲法）、白蛋白（BCG比色法）、球蛋白（BCG比色法）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（酶法）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（酶法）和堿性磷酸酶（連續(xù)監(jiān)測法）等指標(biāo)。

1.3.2 白細(xì)胞分類計數(shù) 血液白細(xì)胞含量及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分類計數(shù)采用日本Sysmex K4500血液自動分析儀測定。

1.4 飼養(yǎng)管理 試驗在動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗室進(jìn)行。舍溫保持在25～27℃，豬欄面積（1.20×1.10）m2，粉料飼喂，自由采食和飲水。按常規(guī)程序定期驅(qū)蟲和免疫。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用SPSS 13.0的GLM模型進(jìn)行兩因子方差分析。模型主效應(yīng)包括日糧處理、免疫應(yīng)激及二者的互作。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛膝多糖和脂多糖刺激對斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響 由表2和表3可見，各階段LPS刺激與ABPS均無互作關(guān)系。由表2可見，在第14天，LPS刺激顯著提高了血漿尿素氮 （P<0.01）、堿性磷酸酶（P<0.05）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（P<0.01）的含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶的比值（P<0.01），而降低了血糖濃度（P<0.001）。ABPS顯著提高了血漿中總蛋白（P<0.05）和球蛋白（P<0.01）含量。由表3可見，在第21天，LPS刺激顯著提高了血漿中堿性磷酸酶（P<0.05）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（P<0.05）的含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶的比值（P<0.01），而降低了總蛋白（P<0.05）和白蛋白（P<0.05）含量。ABPS對21 d的血液生化指標(biāo)無顯著影響。

2.2 牛膝多糖和脂多糖刺激對斷奶仔豬白細(xì)胞分類計數(shù)的影響 由表4可見，除21 d的白細(xì)胞數(shù)量外，LPS刺激與ABPS對白細(xì)胞分類計數(shù)的其他指標(biāo)均無互作關(guān)系 （P>0.05）。在第14天，LPS刺激降低了白細(xì)胞（P<0.001）、淋巴細(xì)胞（P<0.001）、單核細(xì)胞（P<0.001）和中性粒細(xì)胞（P<0.001）的含量及單核細(xì)胞比例（P<0.001）。在第21天，LPS刺激降低了白細(xì)胞 （P<0.001）、淋巴細(xì)胞（P<0.001）的含量及比例（P<0.001），而

提高了中性粒細(xì)胞比例（P<0.001）。ABPS提高了白細(xì)胞（14 d：P<0.10）和中性粒細(xì)胞（14 d：P<0.05；21 d：P<0.05）的含量及中性粒細(xì)胞比例（14 d：P<0.05；21 d：P<0.10），降低了淋巴細(xì)胞比例（14 d：P<0.05；21 d：P<0.10）。

表2 牛膝多糖和脂多糖刺激對斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響（14 d，n=12）

表3 牛膝多糖和脂多糖刺激對斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響（21 d，n=12）

表4 牛膝多糖和脂多糖刺激對斷奶仔豬外周血白細(xì)胞分類計數(shù)的影響（n=12）

3 討論

LPS是革蘭氏陰性菌膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)，能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生急性細(xì)菌感染的厭食、嗜睡、發(fā)熱等癥狀（Gabler和 Spurlock，2008；Liu 等，2008）。LPS 也可導(dǎo)致血液生化指標(biāo)和血液常規(guī)指標(biāo)在短時間內(nèi)（0.5～12 h）呈現(xiàn)異常變化，其中在1～6 h變化最為明顯（石君霞等，2008；Wright等，2000）。本試驗中，LPS刺激可導(dǎo)致斷奶仔豬血液生化指標(biāo)和白細(xì)胞分類計數(shù)發(fā)生顯著變化，這說明LPS刺激可導(dǎo)致斷奶仔豬發(fā)生急性應(yīng)激反應(yīng)。

血清白蛋白、球蛋白和總蛋白含量降低通常是動物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志（劉鈾等，1999）。本試驗中LPS刺激降低了第21天血清總蛋白和白蛋白含量，與劉玉蘭等（2008）的結(jié)果一致。ABPS提高了第21天血清白蛋白和球蛋白含量，這表明ABPS維持了血液中抗體的合成和分泌，進(jìn)而改善了機(jī)體的免疫功能。

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)酶（如谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶）由于細(xì)胞膜的屏障作用不易逸出，僅由細(xì)胞的不斷更新破壞而有少量進(jìn)入血液（王曉霞等，2000），在血清中的活性很低。只有當(dāng)細(xì)胞因各種因素（如急性應(yīng)激）受到損傷時，細(xì)胞膜的通透性升高才會使其釋放入血液的速度增高，血清酶活性顯著升高。因此，血液谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶等活性升高通常也是應(yīng)激反應(yīng)的一個標(biāo)志。雞在熱應(yīng)激時，血液上述三種酶活性均顯著上升（何世山和金小軍，2003）。本試驗中LPS刺激導(dǎo)致了血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活性的升高，說明仔豬受到了強(qiáng)烈應(yīng)激。日糧中添加ABPS對上述酶活性無影響，說明ABPS并沒有改善LPS刺激導(dǎo)致的血液酶活性的變化。由于ABPS作用的強(qiáng)弱與其分子質(zhì)量、溶解度、黏度、給藥時間及給藥途徑等有關(guān)，也受實(shí)驗動物自身生理狀況等多種因素的影響 （陳洪亮，2002），因此ABPS對應(yīng)激仔豬血液酶活性的影響還需要進(jìn)一步的研究。

白細(xì)胞是一個龐大的血細(xì)胞家族，能吞噬異物產(chǎn)生抗體，在機(jī)體損傷治愈、抗御病原的入侵和對疾病的免疫方面起著重要的作用，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥或其他疾病時都可引起白細(xì)胞總數(shù)及各種白細(xì)胞的百分比發(fā)生變化（Han等，2009）。本試驗中，LPS刺激顯著的降低了血液中白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，表明LPS誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生了類似急性細(xì)菌感染癥狀。ABPS提高了血液中白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量及百分含量，表明ABPS對抵御機(jī)體炎癥反應(yīng)方面起一定的作用。有關(guān)ABPS對動物血液中白細(xì)胞分類計數(shù)影響的報道較少。商捷等 （2006）研究發(fā)現(xiàn)，10、5 mg/kg和1 mg/kg劑量的香菇多糖不僅可以抑制X-射線照射和環(huán)磷酰胺（一種免疫抑制劑）導(dǎo)致的小鼠的外周血白細(xì)胞總數(shù)降低，還可使外周血及骨髓白細(xì)胞分類趨于正常。黃民權(quán)和蔡體育（1996）報道，鐵皮石斛多糖能夠抑制試驗條件下環(huán)磷酰胺加入所引起的外周白細(xì)胞數(shù)量劇烈下降。本試驗中ABPS提高了仔豬血液中白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量及百分含量，與上述報道基本一致，表明ABPS在抵御機(jī)體炎癥反應(yīng)方面起到一定的作用。

4 小結(jié)

LPS刺激可導(dǎo)致仔豬血液生化指標(biāo)和白細(xì)胞分類計數(shù)發(fā)生顯著變化，ABPS在一定程度上緩解了上述現(xiàn)象，表現(xiàn)出一定的改善免疫和緩解炎癥的作用。

[1]陳洪亮.植物多糖的制備及對肉仔雞免疫功能影響的研究：[博士學(xué)位論文][D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2002.49～57.

[2]何世山，金小軍.高溫對肉雞血液生化指標(biāo)的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報，農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2003，29（3）：311 ～ 314.

[3]黃民權(quán)，蔡體育.鐵皮石斛多糖對小白鼠白細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞移動抑制因子的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1996，8（3）：39 ～ 41.

[4]李宗鍇，李電東.牛膝多糖的免疫凋節(jié)作用[J].藥學(xué)學(xué)報，1997，32（12）：881～887.

[5]劉鈾，林紅英，羅東君，等.熱應(yīng)激對肉雞血液生化指標(biāo)及內(nèi)分泌機(jī)能的影響[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報，1999，19（1）：61 ～ 64.

[6]劉玉蘭，黃晶晶，范偉，等.L-精氨酸對脂多糖刺激斷奶仔豬生產(chǎn)性能、血液生化指標(biāo)和內(nèi)臟器官重量的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2008，20（2）：140～145.

[7]商捷，劉軍，李可欣，等.香菇多糖對放化療致動物白細(xì)胞減少癥的影響[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2006，23（12）：791 ～ 796.

[8]邵樹軍，買玲，陳瑛.牛膝多糖對小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響[J].中國藥物與臨床，2002，2（5）：281 ～ 282.

[9]石君霞，劉玉蘭，魯晶，等.脂多糖刺激對斷奶仔豬免疫細(xì)胞和免疫器官PPARγmRNA 表達(dá)水平的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39（5）：608 ～ 613.

[10]王曉霞，滑靜，何欣，等.微營養(yǎng)素對熱應(yīng)激期蛋雞血液生化指標(biāo)的影響[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2000，19（1）：3 ～ 6.

[11]Gabler N K，Spurlock M E.Integrating the immune system with the regulation of growth and efficiency[J].J Anim Sci，2008，86：E64 ～ 74.

[12]Han J，Liu Y L，F(xiàn)an W，et al.Dietary L-arginine supplementation alleviates immunosuppression induced by cyclophosphamide in weaned pigs[J].Amino Acids，2009，10.1007/s00726-008-0184-9.

[13]Jin L Q，Zheng Z J，Peng Y，et al.Opposite effects on tumor growth depending on dose of achyranthes bidentata polysaccharides in C57BL/6 mice[J].Int Immunopharmacol，2007，7：568 ～ 577.

[14]Liu Y L，Lu J，Shi J X，et al.Increased expression of the peroxisome proliferator-activated receptor γ in the immune system of weaned pigs after Escherichia coli lipopolysaccharide challenge[J].Vet Immunol Immunopath，2008，124：82 ～ 92.

[15]Mao，X F，Piao X S，Lai C H，et al.Effects of β-glucan obtained from the Chinese herb Astragalus membranaceus and lipopolysaccharide challenge on performance，immunological，adrenal and somatotropic responses of weanling pigs[J].J Anim Sci，2005，83：2775 ～ 2782.

[16]NRC.Nutrient Requirements of Swine[M].10th Ed.，National Academic Press，Washington，D C.1998.

[17]Wright K J，Balaji R，Hill C M，et al.Integrated adrenal，somatotropic，and immune responses of growing pigs to treatment with lipopolysaccharide[J].J Anim Sci，2000，78：1892 ～ 1899.