植物細胞DNA提取與PCR實驗的設計及其關鍵參數的優選

閔運江

(皖西學院化學與生命科學系,安徽六安 237012)

植物細胞DNA提取與PCR實驗的設計及其關鍵參數的優選

閔運江

(皖西學院化學與生命科學系,安徽六安 237012)

以草本類型的蓼科5種植物為實驗材料,研究了DNA提取方法。探討了nrDNA ITS片段的PCR擴增方法,通過正交試驗法,對該實驗的關鍵步驟中PCR體系主要成分的最適含量進行了優化。為植物細胞DNA提取和PCR擴增這一現代生物學必不可少的實驗教學和相關科學研究提供方法借鑒。

DNA提取;PCR擴增;實驗設計;正交試驗;草本植物

植物細胞DNA的提取與擴增實驗是生物學等相關專業本科生必需掌握的實驗技能之一[1](P271-284)[2](P53-55)[3-4],屬于綜合性、設計性實驗。植物細胞DNA的提取與擴增技術又是以上專業學生進一步進入研究生學習階段必備的而又較難掌握的實驗技能之一。

DNA分子雙螺旋結構的發現以及PCR(多聚酶鏈式反應,polymerase chain reaction)技術的建立,分子生物學得到了迅猛的發展,并已滲透到生物學的各門學科領域,已成為生物學各學科中發展速度最快,當今最熱門的研究領域之一[5-12][13]。

DNA提取和PCR擴增操作是研究許多生物學問題必不可少的實驗環節,而大多數學生和研究者常常在此環節傷透腦筋。隨實驗材料的種類、材料保存、運輸條件的差異,以及實驗操作過程的繁雜的實驗條件的改變,其中任何一個參數設置或控制不好,結果就會導致實驗的失敗——無擴增產物或產物不理想,無法測序。

因此,本文以草本類型的蓼科5種植物為例,對其進行DNA提取、PCR擴增nrDNA的 ITS片段(核糖體基因的間隔區 ITS1和 ITS2,包含5.8S基因)等實驗進行設計,實驗中的關鍵步驟的參數,通過正交試驗法進行探索,找到最佳實驗條件,以期對植物分子生物學實驗和研究提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料(見表1)

1.2 實驗設計

1.2.1 實驗步驟

參照已發表的相關文獻資料[14-15]以改良CTAB (Cetyltrimethyle Ammonium Bromide,十六烷基三甲基溴化銨)法,DNA提取與PCR擴增nrDNA ITS片段步驟如下:

(1)改良CTAB法提取DNA

稱取干樣品10～20mg→放入研缽中→加1.5角匙60～80目(AR)的石英砂→加適量液氮→研磨成粉末→將材料轉入2ml離心管中→加4×CTAB液900μl→強烈振蕩混勻 →置 65℃水浴保溫 60～90min,每10min振蕩一次→吸取上清液及部分樣品漿液(除去石英砂)→轉入 1.5ml離心管中 →加600μl氯仿:異戊醇 =24:1的溶液 →強烈振蕩 →1200°r/min離心10min→取上清液→重復一次(即:再次加600μl24:1的氯仿:異戊醇→強烈振蕩混勻→離心)→取上清液→加異丙醇450μl(上下移動30S輕搖)→在-20℃(或4℃)冰箱保存15～30min(材料不好可為4～6h或過夜)→1200°r/min離心5min→此時,應看到離心管底部有白色沉淀→將此沉淀用75%乙醇洗滌1～2次,傾去乙醇→在37℃恒溫金屬浴上風干→加50μlddH2O(無菌超純水)溶解沉淀→加2μl的RNA酶(50mg/μl)→37℃水浴30min→加5～10μl的3M的NaAC和120μl無水乙醇,-20℃保存30min→1200°r/min離心10min→400μl75%乙醇洗滌1次→400μl無水乙醇洗滌1次→離心10S→37℃恒溫金屬浴上風干→加50μl的ddH2O溶解→電泳法檢查DNA純度→-20℃保存,備用。

至此即得到材料DNA(總DNA)模板。

(2)nrDNA ITS片段的擴增

配制好 PCR擴增體系,于 PCR擴增儀(Biorad DNA Engine,上海瑞億儀器有限公司)上,擴增程序是:

擴增結果用1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外檢測器檢查PCR產物。

表1 實驗材料采集地信息表

1.2.2 正交試驗法優選PCR擴增條件

在 PCR擴增中,PCR擴增體系是否適宜,是PCR擴增能否成功的關鍵之關鍵,綜合已發表的相關論文中其他學者所采用的條件,用DPS v7.05軟件設計一個L16(54)正交試驗,即5因素4水平16次試驗的正交試驗(表2、表3),優選出各成分的最佳條件。

正交試驗設計如表3,按正交試驗設計表配制好各體系,10×Buffer各 5μl,并以 dd H2O補足至50μl,按上述nrDNA ITS片段的擴增程序擴增,產物以1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外檢查電泳有無亮帶,根據亮帶的亮度(與擴增產物中DNA片段含量呈正相關)判斷PCR結果是否符合要求,每組試驗結果中以每樣品有清晰明亮的電泳帶定量為1,無亮帶為0,暗帶定義為0.1～0.9,試驗結果見表3和圖1、2。

表2 L16(54)正交試驗因素和水平表(50μl/體系)

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果及其關鍵影響因素

按照以上DNA提取方法,只要樣品材料干燥及時,低溫保存,可以提取出植物細胞總DNA。

DNA提取的關鍵控制環節是防止DNA降解,離體的新鮮材料提取過程中,DNA極易降解。因此,采集的新鮮材料應立即用硅膠脫水干燥,并低溫保存,提取DNA時用液氮研磨等提取過程中,保持低溫等措施,均是防止DNA降解。

同時,采樣和提取DNA過程中防止污染也是試驗必須的控制因素之一。

2.2 PCR擴增體系優選結果及其分析

圖1 ITS片段擴增正交試驗t1-t8組結果

圖2 ITS片段擴增正交試驗t9-t16組結果

表3 L16(54)正交試驗設計及電泳檢查PCR結果及其方差分析結果

各PCR條件的正交試驗結果,經1%瓊脂糖凝膠電泳后,紫外檢測,根據電泳帶的清晰度,可直觀判斷各組每個樣品的PCR產物量(見圖1、2),經量化處理和方差分析結果見表3。

從圖1、2和表3可見,處理組t8的5個樣均有較清晰的電泳帶,其他各處理組或不理想或無 PCR產物,說明t8組條件最佳,即A2B4C3D2E1組合的條件最佳,因此,每50μl PCR體系最佳配方是:10μM引物(1、2)各2.0μl、5U/μl的 Taq酶0.75μl、10mM的dNTP 2μl、DNA模板1μl、25mM的MgCl24μl、10 ×Buffer 5μl,并以dd H2O補足至50μl。

由表3的方差分析結果的極差大小可見,B>C >A>E>D,說明在本試驗采用的各濃度范圍內, PCR體系中,引物量對PCR結果影響最大,其次是Taq酶和dNTP的量。

3 討論

植物DNA提取的方法很多,如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法、十二烷基磺酸鈉(SDS)法、PVP法、高鹽法、尿素提取法和WizardTM clean-up system試劑盒等各種試劑盒法等等[16][17](P60-67),PCR擴增條件也隨著材料和擴增片段不同而千差萬別[18][19]。然而,其基本原理和大致過程是相同或相似的,尤其是同一類材料如草本植物,DNA提取方法、PCR體系組成和合理搭配及PCR程序基本可以通用。本文根據現有本科實驗教學條件,摸索了適合于草本類型的植物細胞DNA提取方法——改良CTAB手工提取法的提取條件,并用正交試驗找出了其PCR擴增的關鍵因素的最佳配比水平,可為相關學科的DNA提取與擴增實驗教學和研究提供方法借鑒。

至于PCR擴增的另一關鍵因素——退火溫度,本試驗設計前已進行反復摸索,采用的是其最佳退火溫度(52℃),該文中未作詳述。

[1]楊安鋼,毛積芳,藥立波.生物化學與分子生物學實驗技術[M].北京:高等教育出版社,2001.

[2]F.M.Ausubel,R.E.Kingston,J.G.Seidman,et al.精編分子生物學實驗指導(第四版)[M].馬學軍,舒躍龍,譯.北京:科學出版社,2005.

[3]叢峰松.生物化學實驗[M].上海:上海交通大學出版社,2005.

[4]胡曉燕,張孟業.生物化學與分子生物學實驗技術[M].濟南:山東大學出版社,2005.

[5]A.Sanchez,T.M.Schuster,K.A.Kron.A Large-scale Phylogeny of Polygonaceae Based on Molecular Data[J]. International Journal of Plant Sciences,2009,170(8):1044 -1055.

[6]L.M.Dávalos,A.L.Porzecanski.Accounting for Molecular Stochasticity in Systematic Revisions:Species limits and Phylogeny of Paroaria[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2009,53:234-248.

[7]L.A.Johnson,L.M.Chan,T.L.Weese,et al.Nuclear and cpDNA Sequences Combined Provide Strong Inference of Higher Phylogenetic Relationships in the Phlox Family (Polemoniaceae)[J].Molecular Phylogenetics and Evolu-tion,2008,48:997-1012.

[8]M.L.Zhang,P.W.Fritsch,B.C.Cruz.Phylogeny of Caragana(Fabaceae)Based on DNA Sequence Data from rbcL, trnS-trnG,and ITS[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2009,50:547-559.

[9]鄭小艷,曹家樹,滕元文.DNA序列分析在植物分子系統學研究中的應用現狀——以薔薇科為例[J].園藝學報, 2009,36(12):1827-1836.

[10]嚴寒靜,房志堅,余世孝.不同種源何首烏的 ITS序列分析及其親緣關系研究[J].西北植物學報,2008,28(5):922 -927.

[11]陳生云,吳桂莉,張得鈞,等.高山植物條紋狹蕊龍膽的分子親緣地理學研究[J].植物分類學報,2008,46(4):573 -585.

[12]孟麗華,楊慧玲,吳桂麗,等.基于葉綠體DNA trnL-F序列研究肋果沙棘的譜系地理學[J].植物分類學報, 2008,46(1):32-40.

[13]A.Falchi,J.Paolini,J.M.Desjobert,et al.Phylogeography of Cistus creticus L.on Corsica and Sardinia inferred by the trnL-F and rpl32-trnL sequences of cpDNA[J]. MolecularPhylogenetics and Evolution,2009,52:538 -543.

[14]童大躍,伍新堯,陸惠玲,等.DNA提取方法的比較及改良[J].中山大學學報,2003,24(4):411-412.

[15]李玥瑩,趙姝華,劉世強.高粱DNA提取純化方法的比較及RAPD反應條件的建立與優化[J].雜糧作物,2001,21 (2):12-15.

[16]侯義龍,曹同,蔡麗娜,等.苔蘚植物DNA提取方法研究[J].廣西植物,2003,23(5):425-428.

[17]彭學賢.植物分子生物技術應用手冊[M].北京:化學工業出版社,2006.

[18]C.Y.Mak,K.S.Cheung,P.Y.Yip,et al.Molecular Evidence for the Hybrid Origin of Bauhinia blakeana(Caesalpinioideae)[J].Journal of Integrative Plant Biology,2008, 50(1):111-118.

[19]J.L.Grimsby,D.Tsirelson,M.A.Gammon,et al.Genetic Diversity and Clonal VS.Sexual Reproduction in Fallopia spp.(Polygonaceae)[J].American Journal of Botany, 2007,94(6):957-964.

The Experiment Design and Its Key Parameters Optimization of Isolation and PCR Amplification DNA Fragment from Plant Cell

MIN Yun-jiang
(Department of Chemistry and L if e Science,West A nhui University,L u’an237012,China)

The experiments had been designed which plant cell DNA isolation and its nrDNA ITS fragment PCR amplification,with 5 species herbaceous materials of Polygonaceae.The key step of the experiment the main components of the PCR system optimum concentration had been optimized by the orthogonal test method.The results of this experiment will provide an example to our experimental teaching and related research.

DNA isolation;PCR amplification;experiment design;the orthogonal test method;herbaceous

Q94-33

A

1009-9735(2010)02-0089-04

2010-03-18

安徽省教育廳2010年度高校省級科學研究重點項目(KJ2010A327)。

閔運江(1963-),男,安徽金寨人,碩士,在讀博士,副教授,研究方向:植物分子生態。