卵泡液中白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素18與體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局的相關(guān)性

王秀霞，王天任，何麗霞，孔琳，徐小延，楊大磊

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

體外受精-胚胎移植技術(shù)誕生已經(jīng)30余年，雖然其臨床妊娠率在逐漸增高，但仍停留在40%左右，即在接受治療的患者中仍然有一半以上不能成功妊娠，即使妊娠的患者也存在高于自然的流產(chǎn)率，實(shí)際抱嬰回家率僅有25%左右，因此探討影響體外受精-胚胎移植臨床妊娠的因素及預(yù)測(cè)指標(biāo)對(duì)于提高其成功率具有重要的意義。前期研究結(jié)果顯示，卵泡液中NK細(xì)胞百分比及活化NK細(xì)胞百分比增加與體外受精-胚胎移植助孕治療的不良妊娠結(jié)局相關(guān)［1］。細(xì)胞因子白細(xì)胞介素 2（interleukin-2，IL-2）、白細(xì)胞介素 12（interleukin-12，IL-12）和白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）均有較強(qiáng)的活化 NK 細(xì)胞的作用，而且研究證明，在自然妊娠婦女外周血中IL-2、IL-12 和 IL-18 的水平與不良妊娠結(jié)局相關(guān)［2，3］，但其與體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局的關(guān)系尚未見報(bào)道。本文檢測(cè)了卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18的水平并探討其與妊娠結(jié)局的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2007年7月至2009年4月在我院輔助生殖中心接受體外受精-胚胎移植助孕治療的不孕癥患者117例，年齡在35歲以下，不孕原因?yàn)閱渭冚斅压茏枞袑?duì)象均排除其他內(nèi)分泌疾病，無心、肝、腎等疾病，近3個(gè)月來未應(yīng)用激素類藥物，進(jìn)入周期前所有化驗(yàn)指標(biāo)均為正常，基礎(chǔ)促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平<10 mIU/L。

1.2 研究方法

1.2.1 超排卵方案：117例研究對(duì)象均采用常規(guī)長(zhǎng)方案，于上一個(gè)月經(jīng)周期的黃體高峰期（即月經(jīng)周期21 d左右）肌注促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasing hormone agonist，GnRH-a，商品名達(dá)菲林，易普生公司提供），于本周期月經(jīng)來潮的第3天應(yīng)用FSH（商品名果那芬，瑞士雪蘭諾公司提供），每日1次，具體劑量根據(jù)患者情況150～225 IU不等，皮下注射。持續(xù)至卵泡成熟，當(dāng)有3個(gè)卵泡直徑≥16 mm，或1個(gè)≥18 mm、2個(gè)≥16 mm時(shí)，結(jié)合患者血中激素水平給予人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG，麗珠公司提供）注射，常規(guī)為5 000～10 000 IU，注射后34～36 h取卵。

1.2.2 卵子回收和卵泡液的采集和保存：采用B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵術(shù)，選擇直徑≥16 mm的卵泡穿刺取卵，留取第一管無明顯血染的卵泡液，排除空卵泡的卵泡液，立即以500g離心10 min，取上清液分裝于冷凍管中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ占涗浕颊叩脑敿?xì)資料，包括患者年齡、本周期獲卵數(shù)、子宮內(nèi)膜形態(tài)、厚度以及妊娠結(jié)局等。所有標(biāo)本的采集均得到本院倫理委員會(huì)的通過并征得患者本人同意。

1.2.3 IL-2、IL-12和IL-18水平的測(cè)定：應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法檢測(cè)卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18的水平，人ELISA試劑盒（96T）購(gòu)自美國(guó)Bender公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)量資料以±s表示，應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 妊娠組與未妊娠組患者基本特征的比較

117例接受體外受精-胚胎移植助孕治療的患者根據(jù)移植后14 d血HCG水平確定生化妊娠，HCG<20 mIU/ml者為未妊娠組，共58例；HCG>20 mIU/ml、第35天B超下見到原始心血管搏動(dòng)為妊娠組，共59例。兩組患者的年齡、血清激素水平、促排卵所用藥物劑量、獲卵數(shù)等指標(biāo)無顯著差異，具有可比性（表 1）。

表1 妊娠組與未妊娠組基本特征比較（±s）Tab.1 General items between pregnancy group and non-pregnancy group（±s）

表1 妊娠組與未妊娠組基本特征比較（±s）Tab.1 General items between pregnancy group and non-pregnancy group（±s）

Item Pregnancy group（n=59） Non-pregnancy group（n=58） P Age（year） 29.56±3.15 29.83±3.01 0.64 Basal FSH（mIU/ml） 7.09±1.64 7.28±1.65 0.54 FSH duration（day） 9.47±1.96 9.16±2.06 0.39 FSH dosage（IU） 2 085.0±592.5 1 995.0±504.8 0.38 Endometrial thickness on HCG day（mm） 11.12±2.17 10.57±2.19 0.18 Numbers of oocyte retrieved（n） 12.66±7.59 11.93±6.31 0.57

2.2 妊娠組與未妊娠組患者卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18水平的比較

未妊娠組卵泡液中IL-2的濃度為（40.89±22.83）pg/ml，高于妊娠組的（36.73±18.53）pg/ml，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。未妊娠組卵泡液中IL-12的濃度為（1.59±1.58）pg/ml、IL-18的濃度為（131.8±162.35）pg/ml，高于妊娠組的 IL-12 （0.52±0.88）pg/ml和 IL-18（76.10±69.06）pg/ml，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。

3 討論

眾所周知，T淋巴細(xì)胞有Th1和Th2兩個(gè)亞群，Th1型淋巴細(xì)胞主要是細(xì)胞毒的殺傷作用，Th2型淋巴細(xì)胞主要是免疫保護(hù)作用，兩者通過各自分泌的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能。成功妊娠的建立和維持需要Th1和Th2功能的平衡，Th1型淋巴細(xì)胞功能占主導(dǎo)時(shí)，可導(dǎo)致妊娠失敗。前期研究結(jié)果顯示，卵泡液中活化NK細(xì)胞濃度和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）濃度的增加均與體外受精-胚胎移植臨床妊娠失敗相關(guān)，而TNF-α與卵丘顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)［4］。細(xì)胞因子IL-2和IL-12是Th1型主要細(xì)胞因子，IL-18是重要的炎性細(xì)胞因子，是Th1細(xì)胞的輔助因子，三者均具有刺激NK細(xì)胞活化、分泌IFN-γ等細(xì)胞因子、發(fā)揮細(xì)胞毒的作用。研究證明，習(xí)慣性流產(chǎn)患者血中上述3種細(xì)胞因子水平均增加，提示其參與胚胎的免疫耐受，在妊娠調(diào)節(jié)方面具有重要作用，因此其在體外受精-胚胎移植中的作用受到了關(guān)注［2，3］。

Ledee等［5］檢測(cè)了卵泡液中細(xì)胞因子水平和其對(duì)應(yīng)的卵子發(fā)育狀態(tài)兩者間的相關(guān)性，結(jié)果顯示卵泡液中IL-2的濃度與胚胎早期卵裂相關(guān)，表明IL-2對(duì)于早期胚胎發(fā)育可能起到促進(jìn)作用，而IL-12水平則與胚胎碎片率有關(guān)。另有研究顯示卵泡液中IL-12與卵細(xì)胞成熟及受精相關(guān)，IL-12濃度越高，成熟度越差，受精率越低，因此提出卵泡液中IL-12水平可作為預(yù)測(cè)體外受精-胚胎移植陰性結(jié)局的指標(biāo)［6，7］。Ledee-Bataille［8］探討了接受體外受精-胚胎移植患者取卵日宮腔分泌物中IL-18水平，結(jié)果顯示含量高者妊娠率低；Gutman等［9］證實(shí)了卵泡液中存在IL-18，并認(rèn)為體外受精-胚胎移植患者超排卵周期卵泡液中IL-18濃度比自然周期增高，并證實(shí)發(fā)生卵巢過度刺激綜合征的患者成熟卵泡IL-18濃度高于未發(fā)生卵巢過度刺激綜合征的患者。但其與體外受精-胚胎移植臨床妊娠結(jié)局的關(guān)系尚未見報(bào)道。

本研究檢測(cè)了接受體外受精-胚胎移植妊娠與未妊娠患者卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18的濃度，結(jié)果顯示卵泡液中IL-2濃度與臨床妊娠結(jié)局無相關(guān)關(guān)系，而IL-12和IL-18濃度均為妊娠組低于未妊娠組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。IL-2作為Th1細(xì)胞因子具有活化NK細(xì)胞、使其分泌IFN-γ的作用。前期研究結(jié)果顯示卵泡液中活化的NK細(xì)胞及卵泡液中IFN-γ與不良的妊娠結(jié)局相關(guān)，但本研究卻未獲得其與不良妊娠結(jié)局相關(guān)的結(jié)果。結(jié)合Ledee［5］研究的卵泡液中IL-2與胚胎早期卵裂相關(guān)，提示卵泡液中IL-2可能未發(fā)揮Th1因子的刺激NK細(xì)胞活化、繼之產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子而導(dǎo)致不良結(jié)局的作用，而是發(fā)揮了促進(jìn)胚胎發(fā)育的積極作用。但其調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。如前所述，卵泡液中IL-12水平增高與胚胎質(zhì)量下降相關(guān)，推測(cè)在卵巢中各卵泡間存在滲透作用或某種誘因?qū)е赂髀雅菀褐蠭L-12增高，使所獲卵子質(zhì)量總體下降，進(jìn)而影響胚胎種植，導(dǎo)致臨床妊娠失敗。此推論尚需對(duì)卵巢中不同卵泡液和卵巢動(dòng)脈血中IL-12水平進(jìn)行檢測(cè)才能證明。IL-18水平增高與不良的妊娠結(jié)局相關(guān)，推測(cè)是由于激活卵泡液中NK細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子；而且在IL-12的協(xié)同作用下，IL-18具有促進(jìn)體內(nèi)免疫向Th1方向轉(zhuǎn)化作用；最新研究顯示IL-18還能使γδT細(xì)胞增殖，使IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子分泌增加［10］。經(jīng)此3種調(diào)節(jié)途徑使卵泡內(nèi)環(huán)境中Th1型細(xì)胞因子增加，導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育不良以及滲透至子宮內(nèi)膜使種植窗條件改變，影響胚胎種植，最終導(dǎo)致妊娠失敗。此推論有待今后進(jìn)一步研究。

探討細(xì)胞因子與體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局的關(guān)系，將為臨床應(yīng)用藥物調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫狀態(tài)、改善臨床妊娠結(jié)局提供理論基礎(chǔ)和監(jiān)測(cè)指標(biāo)，對(duì)提高體外受精-胚胎移植臨床妊娠率具有重要意義。

［1］王秀霞，張合龍，何麗霞，等.卵泡液中NK細(xì)胞及其活化與體外受精結(jié)局關(guān)系的探討［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，38（10）：770-772.

［2］Hadinedoushan H，Mirahmadian M，Aflatounian A.Increased natural killer cell cytotoxicity and IL-2 production in recurrent spontaneous abortion［J］.Am J Reprod Immunol，2007，58（5）：409-414.

［3］Wilson R，Jenkins C，Miller H.Abnormal cytokine levels in nonpregnantwomenwithahistoryofrecurrentmiscarriage［J］.EurJObstet Gynecol Reprod Biol，2004，115（1）：51-54.

［4］王秀霞，易曉芳，何麗霞，等.卵泡液中腫瘤壞死因子α和γ干擾素水平對(duì)體外受精妊娠結(jié)局的影響［J］.中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科學(xué)雜志，2009，25（11）：859-860.

［5］Ledee N，Lombroso R，Lombardelli L，et al.Cytokines and chemokines in follicular fluids and potential of the corresponding embryo：the role ofgranulocytecolony-stimulatingfactor［J］.HumReprod，2008，23（9）：2001-2009.

［6］Coskun S，Uzumcu M，Jaroudi K，et al.Presence of leukemia inhibitory factor and interleukin-12 in human follicular fluid during follicular growth［J］.Am J Reprod Immunol，1998，40（1）：13-18.

［7］Gazvani MR，Bates M，Vince G，et al.Follicular fluid concentrations ofinterleukin-12andinterleukin-8inIVFcycles［J］.FertilSteril，2000，74（5）：953-958.

［8］Ledee-Bataille N，Olivennes F，Kadoch J，et al.Detectable levels of interleukin-18 in uterine luminal secretions at oocyte retrieval predictfailureoftheembryotransfer［J］.HumReprod，2004，19（9）：1968-1973.

［9］Gutman G，Soussan-Gutman L，Malcov M，et al.Interleukin-18 is high in the serum of IVF pregnancies with ovarian hyperstimulation syndrome［J］.Am J Reprod Immunol，2004，51（5）：381-384.

［10］Li W，Yamamoto H，Kubo S，et al.Modulation of innate immunity by IL-18［J］.J Reprod Immunol，2009，83（1-2）：101-105.