穩定表達Bcl-2的骨髓間充質干細胞載體的建立及對缺血性損傷保護作用的實驗研究

何凡，何志義，李蕾，秦雪，鄧淑敏，劉芳，阮杏林，馮程程

（1.中國醫科大學 第一附屬醫院神經內科，沈陽 110001；2.沈陽軍區總醫院 神經內科，沈陽 110016）

近年來，干細胞移植作為一種不同于傳統治療的全新方法，能重塑受損的神經元通路和改善神經功能缺失而成為缺血性腦血管病治療方面的研究熱點［1］。用于治療缺血性腦血管病的干細胞包括神經干細胞（neural stem cell，NSC）和骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MSC）。神經干細胞來源于人的腦組織或人胚胎干細胞，受醫學倫理限制，不適合自體移植。MSC更適合用于缺血性腦血管病的干細胞移植治療［2～4］。而MSC移植入體內后的低成活率限制了其應用。Chen等［5］研究發現，MSC的神經細胞轉化率在體外可高達80%，而在體內僅約為3%～10%，其原因雖然復雜，但主要是MSC移植至體內后，其自身發生凋亡所致。因此，如何減少其移植后凋亡的發生，提高MSC在體內的存活率及向神經細胞定向分化的能力是目前干細胞移植治療腦缺血亟待解決的問題。

B cell lymphoma/leukemia gene 2（Bcl-2）是目前研究較為明確的抗凋亡基因。本研究擬采用慢病毒法將Bcl-2轉導入MSC中，旨在增加MSC對Bcl-2的表達，提高MSC的存活率，為進一步解決MSC在體內凋亡率高的問題打下堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Gateway?BP ClonaseTMII Enzyme Mix、Gateway?LR ClonaseTMIIPlusEnzymeMix、LipofectamineTM2000、Opti-MEM I Reduced Serum Medium 均 購 自invitrogen公司。普TRI REAGENT購自美國MRC。RQ1 RNase-Free DNase購自美國Promega。RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit、Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、GeneRulerTM100 bp DNA Ladder、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自美國 Fermentas公司。Puromycin、Polybrene、B-ME（2-巰基乙醇）購自Sigma公司。通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提中量試劑盒購自TIANGEN公司。Neomycin、D/F12購自Gibco公司。F344大鼠間質干完全培養基、PBS、消化胰酶購自Cyagen公司。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。F344大鼠骨髓基質干細胞購自賽業（廣州）生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Bcl-2慢病毒載體構建及鑒定：根據小鼠Bcl-2序列設計引物，在5′端分別加上attB1和attB2位點，上下游引物分別為：5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGCGCAAGCCGG GAGAAC 3′與 5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTTCACTTGTGGCCCAGGTATG 3′以 小 鼠cDNA為模板，以上述設計引物進行PCR擴增。PCR產物通過電泳檢測后進行回收，純化。BP結合反應-構建pDOWN-mBcl-2載體。將BP反應物轉化到感受態One Shot OmniMAXTM2 T1 Phage-Resistant CellsE.coli株中。LR結合反應-構建pLV/EXPN2-Puro-EF1A-mBcl2表達載體，將LR反應物轉化到感受態One Shot?Mach1TMT1R Chemically CompetentE.coli株中。篩選出重組子后提取質粒進行測序檢測。

1.2.2 Bcl-2慢病毒轉導大鼠間質干細胞及鑒定：轉導前1 d（第1天），按照合適的細胞數量把細胞接種到6孔板中，使轉導當天的細胞融合度達到30%～50%；轉導當天（第2天），融解攜帶mBcl-2慢病毒濃縮液；去除培養液，加入1 ml F344大鼠間質干完全培養基和100 μl的mBcl-2慢病毒濃縮液；每孔細胞可加入Polybrene促進病毒感染細胞（終濃度6 μg/mL），放置37℃、5%CO2飽和濕度培養箱過夜培養；轉導8 h后，去除含有病毒的培養液，并加入新鮮的完全培養液。放置37℃、5%CO2飽和濕度培養箱過夜培養；轉導24 h后，去除含有病毒的培養液，并加入含有Puromycin（4 μg/mL）的完全培養液來篩選被穩定轉導的細胞。放置37℃、5%CO2飽和濕度培養箱過夜培養。RT-PCR法檢測轉染后Bcl-2的表達。

1.2.3 Bcl-2 Rat F344 MSC抗凋亡檢測：分別準備T75瓶F344MSC及Bcl-2/F344 MSC，待細胞約80%～90%匯合時分別傳至6孔板中，37℃5%CO2培養約24 h，至孔內細胞約90%以上匯合。參照Zhu等的方法［6］通過血清和氧剝奪（serum and oxygen eprivation，SOD）方式建立MSC體外模擬缺血損傷的細胞模型。流式鑒定細胞凋亡率按試劑盒說明書進行上機前操作，其中1孔做空白對照，1孔做Annexin-FITC單標對照，1孔做PI單標對照，剩1孔做實驗組，每組重復3次。

1.2.4 Bcl-2 Rat F344 MSC神經誘導及檢測：復蘇的Bcl-2 F344 MSC傳代，按照1∶2傳代1次，用于做神經誘導；細胞傳到6孔板中，所有的細胞按照基本相同的密度接種；細胞在50%～60%匯合時，加入1 mmol/L β-ME（DMEM-20%FBS）處理 24 h，進行預誘導；換液前用PBS洗滌3次，洗去FBS，加入5mmol/L β-ME（DMEM-0%FBS）誘導5～6 h。本實驗選取NSE和Vimentin作標記。以Gapdh基因作為內參。神經元特異型烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE），作為神經元的標記。波形蛋白（Vimentin）作為神經膠質細胞的標記，RT-PCR法檢測NSE和Vimentin的表達。

2 結果

2.1 穩定轉導Bcl-2基因的MSC的篩選及Bcl-2基因的檢測

轉導Bcl-2的MSC用Puro篩選，作用3 d后呈現細胞死亡現象，與陰性對照相比，轉導過的F344大鼠間充質干細胞的存活細胞明顯多于野生型F344大鼠。Puro作用8 d后，細胞出現增殖現象。與陰性對照相比，轉導過的F344大鼠間充質干細胞的存活細胞明顯多于野生型F344大鼠。Puro作用8 d后撤藥，換成正常完全培養基培養，各個藥物濃度篩選過的細胞繼續生長，完成抗藥性細胞篩選。RT-PCR法檢測轉導后細胞內Bcl-2基因的表達情況見圖1。

2.2 SOD誘導細胞凋亡的流式細胞術檢測（圖2）

Bcl-2/F344MSC早期細胞凋亡率為（18.95±2.57）%，F344 MSC 早期細胞凋亡率為（30.87±5.69）%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01）。

2.3 神經誘導細胞RT-PCR結果

細胞預誘導后有較多成球形細胞，但是大部分細胞為短梭形貼壁增殖；誘導后細胞成球形和拉絲回縮明顯，細胞貼壁性下降明顯有懸浮的趨勢。結果顯示無論經過誘導或者沒經過誘導的細胞都表達NSE和Vimentin。經過對電泳條帶的光密度測量，經過誘導的細胞表達NSE的量比沒經過誘導的細胞表達NSE的量要大近1倍。而Vimentin的表達量在這兩種細胞中基本沒差別（圖3）。

3 討論

MSC具有貼壁生長的特性，且體外培養能夠不斷的分裂和增殖，遺傳性能穩定，易于進行外源基因的轉染及蛋白的表達［7］。Bcl-2是Tsujimoto等從濾泡性淋巴瘤中分離出來的一種原癌基因，能對抗多種原因引起的細胞凋亡，被認為是能夠抑制細胞凋亡發生的“抗凋亡基因”。盡管Bcl-2最初是作為一種原癌基因被認識的，但它對正常細胞的增殖和分化沒有影響，不會導致細胞的惡性轉化而發生癌變。因此Bcl-2可作為外源性基因轉染MSC，起到基因及干細胞治療的雙重作用。最近Li等［8］將Bcl-2基因修飾的MSC移植入心肌梗死大鼠模型，發現Bcl-2能夠增加移植后的MSC的存活率，并且不影響MSC的多向分化潛能，心肌梗死灶周圍的毛細血管密度增加15%，心肌梗死病灶縮小17%，心肌功能得到明顯改善。目前常用的細胞轉染方法包括脂質體轉染法和病毒載體法，常用的病毒包括腺病毒、單純皰疹病毒、逆轉錄病毒和慢病毒。慢病毒與逆轉錄病毒載體法均為高效轉基因方法，可使目的基因轉導入載體細胞的基因組中，并持續表達目的基因。逆轉錄病毒載體法依賴細胞分裂周期，而慢病毒載體法并不依賴細胞分裂周期。因此本研究采用慢病毒轉染的方法，獲得穩定、高效表達Bcl-2的細胞株。

在MSC移植治療神經系統疾病的研究中對腦缺血的治療研究最多。導致神經細胞凋亡和壞死的腦缺血惡劣的病理生理環境必然對MSC存活及發揮其治療功效構成極大的威脅。本研究參照Zhu等的方法［6］以SOD處理來模擬腦缺血，結果顯示SOD可誘導MSC的凋亡。經Bcl-2基因轉染的MSC的凋亡明顯減少，存活細胞明顯增加，這說明Bcl-2基因轉染對MSC體外模擬缺血性損傷有保護作用，攜帶有Bcl-2基因的細胞抗凋亡能力比正常細胞強。使Bcl-2基因修飾的MSC移植治療腦缺血而發揮其更大治療效應成為可能。

MSC是來源于骨髓的一種具有自我復制和多向分化潛能的非造血干細胞，不僅可以分化為骨、軟骨、脂肪等間質細胞，在適宜的條件下，還能分化為神經細胞［9］。本研究提示，轉導了Bcl-2基因的MSC仍具有向神經細胞分化的潛能。說明轉導了Bcl-2基因的MSC在基因治療過程中，仍能發揮其干細胞的作用。本實驗只作為F344MSC-mBcl2/eGFP向神經細胞分化能力的檢測，經過誘導的細胞表達NSE較多，可能與其自身抗凋亡能力強，細胞存活時間長有關。轉導Bcl-2基因后，提高了MSC在體內的存活率及向神經細胞定向分化的能力，從而為下一步Bcl-2基因修飾的MSC移植治療腦缺血的實驗研究奠定基礎。

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