急性肝壞死動物模型腸道SIgA的變化

劉冬妍，丁鵬，劉沛

（中國醫科大學1.附屬盛京醫院實驗研究中心，沈陽 110004；2.附屬第一醫院感染科，沈陽 110001）

肝壞死是一類肝細胞廣泛壞死的晚期病癥，患者可出現消化道出血、內毒素血癥、自發性腹膜炎、肝性腦病、中毒性鼓腸、甚至敗血癥等。腸黏膜免疫系統在機體擔任第一線的局部防御任務，黏膜免疫是抑制免疫不是激活免疫［1］，黏膜免疫系統由許多機制抵抗各種損傷以保護宿主，如分泌性免疫球蛋白（secretory IgA，SIgA）、腸上皮淋巴細胞。腸黏膜SIgA是腸道第一線的免疫防御，對黏膜固有的和入侵的病原體具有保護作用，尤其對腸道菌群中的G-桿菌具有特殊的親和力［2］，阻止其與腸上皮細胞的吸附，避免細菌穿透腸上皮發生易位，是阻止細菌易位的重要環節。因而在探討急性肝壞死并發自發性腹膜炎發生機制時，研究腸道SIgA變化至關重要。本研究檢測急性肝壞死動物模型血清、糞便內SIgA，并檢測腸壁內IgA的蛋白定位，以了解急性肝壞死腸道免疫防御功能的改變。

1 材料與方法

1.1 動物分組及動物模型建立

由中國醫科大學動物中心提供雄性Balb/C小鼠250只，6～8周齡，體質量18～22 g，隨機分為4組。1組：生理鹽水對照組，50只；2組：LPS（E.coliO127：B8） 組，50 只；3 組：D-氨基半乳糖組（GalN組），50只；4組：肝壞死組（LPS+GalN 組），100只。各組分 5 個時間點（2，6，9，12，24 h），每個時間點取10 只小鼠。GalN 800 mg/kg，LPS 10 μg/kg，均為腹腔注射，生理鹽水為相同體積的腹腔注射，在不同時間點處死小鼠取肝腸組織。

1.2 標本的處理

（1）摘眼球取血，待充分凝固后，3 000 r/min離心取上清，-30℃冰凍保存待用；（2）取干便稱重，按1/10加入pH7.4的PBS，漩渦振蕩器充分震蕩后以10 000 r/min低溫離心機離心，取上清-30℃冰凍保存待用。

1.3 ELISA方法檢測血清、糞便IgA

用抗小鼠IgA抗體（Sigma公司）包被96孔聚苯乙烯反應板4℃過夜。10%小牛血清封閉，依次加入標本、生物素標記的抗小鼠IgA抗體（Sigma公司）、卵白素耦聯的辣根過氧化物酶（Sigma公司）和底物，用硫酸終止反應，以包被液做空白對照，封閉液做陰性對照，450 nm波長檢測吸光度值（A值）［3］。

1.4 放射免疫方法檢測糞便SIgA

從冰箱中取出糞便上清液和血清平衡到室溫，設立非特異標準管、零標準管、6個標準管、T管。T管僅加I125-SIgA，非特異標準管加I125-SIgA和非特異結合試劑，零標準管加I125-SIgA和SIgA抗體，6個標準管加I125-SIgA、SIgA抗體和不同濃度的標準品，樣品管依次加入100 μl標本、I125-SIgA和SIgA抗體，充分混勻，37℃溫育1.5 h，加入第二抗體和PEG，充分混勻，37℃孵育0.5 h，3 500 r/min離心15 min，棄上清，沉淀和T管在γ閃爍技術儀上計數60 s，計數非特異結合率。

1.5 腸上皮IgA免疫組化染色

頸椎脫臼處死小鼠，取腸組織，迅速放入福爾馬林中，石蠟包埋后切成6 μm厚切片，常規二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，然后依次加入H2O2、兔血清、1∶800稀釋的抗SC抗體（美國ICN公司）、生物素標記的IgG抗體、酶標記的卵白素、DAB顯色。用圖像分析軟件分析SC染色的平均OD值。

1.6 統計學處理

采用SPSS 10.0軟件進行t檢驗，數據以±s表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組動物死亡情況

第4組小鼠注射以后，出現懶動，攝水、覓食減少，皮毛松散，甚至抽搐，于注射后6 h開始死亡，9 h達高峰，死亡率達56%。

2.2 動物模型腸、肝組織形態學檢查

2.2.1 肝組織：HE染色光鏡下由LPS/GalN引起的急性肝壞死隨時間逐漸加重，2 h肝臟有少量點狀壞死，6 h肝臟出現多處點狀壞死，9 h、12 h可見成片的出血性壞死，殘存的肝細胞腫脹，壞死區可見大量炎細胞。24 h有多處點狀壞死，肝細胞腫脹，多處出血，灶狀壞死處有淋巴細胞浸潤（圖1）。

2.2.2 腸組織：HE染色光鏡下見對照組腸絨毛完整，無上皮脫落及碎屑形成，壞死組部分絨毛不整，細胞水腫及炎細胞浸潤（圖2）。

2.3 糞便SIgA的變化

LPS引起的肝壞死小鼠便SIgA含量升高與對照組相比均有統計學差異（P<0.01），在9 h達到高峰，注射LPS、GalN亦引起便SIgA含量升高（圖3）。

2.4 糞便、血液IgA的變化

注射LPS+GalN 6 h便、血清IgA開始升高，維持到24h，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.01）。見圖4。

2.5 腸上皮IgA變化

IgA染色可見正常腸組織腸上皮細胞質、細胞膜和固有層活化淋巴細胞呈棕黃色強陽性；急性肝壞死腸組織腸上皮細胞質陽性明顯減弱（圖5），IgA的光密度變化如圖6。

3 討論

腸道在嚴重疾病伴發的多器官功能衰竭中起主要作用［4］，在此過程中腸道黏膜SIgA是一個重要參與因素，它能阻止細菌［5］、病毒［6～8］和其他毒性分子粘附在黏膜表面。

我們應用LPS和GalN聯合注射建立急性肝壞死動物模型，GalN是一種氨基糖，在肝內通過半乳糖途徑代謝，消耗半乳糖代謝途徑的中間產物尿苷二磷酸，進而抑制尿嘧啶核苷的代謝，通過抑制肝細胞RNA和漿膜蛋白的合成造成肝細胞破壞［9］。GalN可使動物對LPS的敏感性呈萬倍的增加，而肝壞死引起的內毒素血癥進一步加重GalN的肝毒性［10］。對實驗小鼠肝臟進行形態學檢查發現，由LPS和GalN引起的急性肝壞死隨時間逐漸加重，在9 h最重，可見肝臟體積明顯變大，顏色呈醬紫色，HE染色可見成片的出血性壞死，殘存的肝細胞腫脹，壞死區可見大量炎細胞。國外有報道嚴重酒精性肝病時血清SIgA顯著增高，腸道SIgA顯著下降［11］，但也有報道在酒精性肝病時腸道IgA明顯升高［12］。慢性病毒性肝炎和肝硬化患兒唾液和糞便濾過液SIgA升高，呈現高球蛋白血癥癥狀，局部免疫功能增強［13］。用螺旋菌誘導的慢性活動性肝炎小鼠糞便和膽汁內IgA均顯著高于正常對照組［14］。我們結果顯示，注射后壞死組糞便IgA和SIgA、血液IgA均顯著高于對照組、LPS組、GalN 組（P<0.01），在 9 h達最高，即肝壞死越重，血清IgA和便中IgA、SIgA越高。小鼠SC介導IgA運輸不僅在腸道而且可以在肝臟，由于肝細胞IgA泵的缺失導致血清IgA升高，大量IgA堆積肝臟，同時由于IgA的腸肝循環［15］，肝臟內的IgA通過腸肝循環進入腸道引起糞便中IgA增加，因此小鼠糞便IgA不能反映腸道真實IgA的分泌情況［16］。我們對腸組織進行免疫組化染色，發現由LPS+GalN引起的IgA免疫組化光密度明顯低于對照組、LPS組。因此我們推測即使便中SIgA、IgA升高，但在急性肝壞死時由于腸黏膜上皮細胞表面IgA（SIgA）減少，導致腸道免疫功能下降。同時急性肝壞死時腸道營養不良可能也是引起腸黏膜上皮細胞表面IgA減少的原因。由于IgA是SIgA的重要組成成分，SIgA又是腸道第一線免疫防御，因此IgA減少可能是急性肝壞死并發腹膜炎的一個原因。

［1］Nagler-Anderson C，Shi HN.Peripheral nonresponsiveness to orally administered soluble protein antigens［J］.Crit Rev Immunol，2001，21（1-3）：121-131.

［2］Alverdy JA，Aoys E，Weiss-Carrington P，et al.The effect of glutamine-enriched TPN on gut immune cellularity［J］.J Surg Res，1992，52（1）：34-38.

［3］呂颯，宋紅麗，王靜艷，等.急性肝壞死小鼠血腦屏障通透性的改變［J］.世界華人消化雜志，2004，12（6）：1346-1348.

［4］Hideki A，Yuji I，Chikara A.Characterization of mouse nasal lymphocytes isolated by enzymatic extraction with collagenase［J］.J Immunol Meth，1995，187（1）：41-51.

［5］Langkamg-Henken B，Donovan TB，Pate LM，et al.Increased intestinal permeability following blunt and penetrating trauma［J］.Crit Care Med，1995，23（4）：660-664.

［6］Kudsk KA.Current aspects of mucosal immunology and its influence by nutrition［J］.Am J Surg，2002，183（4）：390-398.

［7］Mazanec MB，Nedrud JG，Kaetzel CS，et al.A three-tiered view of the roleofIgAin mucosal defense［J］.Immunol Today，1993，14（9）：430-435.

［8］Mantis NJ，Farrant SA，Mehta S.Oligosaccharide side chains on humansecretoryIgAserveasreceptorsforricin［J］.JImmunol，2004；172（11）：6838-6845.

［9］Bomsel M.Transcytosis of infectious human immunodeficiency virus across a tight human epithelial cell line barrier［J］.Nat Med，1997，3（1）：42-47.

［10］McmillanJM，JolliwDJ.Galactosaminehepatotoxicityeffectofgalactosamine on glutathione resynthesis in rat primary hepatocyte curtures［J］.Toxiclo Appl Pharmacol，1992，115（2）：234-240.

［11］Kasravi FB，Wang L.Wang XD，et al.Bacterial translocation in acute liver injury induced by D-galactosamine［J］.Hepatology，1996，23（1）：97-103.

［12］Pelletier G，Briantais MJ，Buffet C，et al.Serum and intestinal secretory IgA in alcoholic cirrhosis of the liver［J］.Gut，1982，23（6）：475-480.

［13］Parlesak A，Schafter C，Bode C.IgA against gut-derived endotoxins：does it contribute to suppression of hepatic inflammation in alcoholinduced liver disease?［J］.Dig Dis Sci，2002，47（4）：760-766.

［14］Amarian GG，Mikhailovich ZM，Fokina TV.Secretory humoral immunity in children with chronic viral diseases of the liver［J］.Pediatriia，1990，（5）：37-42.

［15］Whary MT，Morgan TJ，Dangler CA.Chronic active hepatitis induced by Helicobacter hepaticus in the A/JCr mouse in associated withaTh1cell-mediatedimmuneresponse［J］.InfectImmune，1998，66（7）：3142-3148.

［16］Kilian M，Reinholdt J，Lomholt H，et al.Biological significance of I－gA1 proteases in bacterial colonization and pathogenesis：critical evaluation of experimental evidence［J］.APMIS，1996，104（5）：321-338.

［17］Nakamura Y，Nosaka S，Suzuki M，et al.Dietary fructooligosaccharides up-regulate immunoglobulin A response and polymeric immunoglobulin receptor expression in intestines of infant mice［J］.Clin Exp Immuunol，2004，137（1）；52-58.