羽毛角蛋白降解的研究進展

王巍杰 程紅燕 楊永強

動物的大量消費產生許多羽毛廢棄物，傳統處理方法主要為填埋、焚燒和產氣，對環境造成很大危害。利用家禽羽毛制備動物飼料的研究較早，已經取得一定規模的應用發展，但羽毛中90%的角蛋白未被高效利用，造成可利用資源的浪費。角蛋白作為羽毛的主要成分，已經應用于化妝品行業，或作為復合材料、纖維制品的組分被利用。角蛋白因大量二硫鍵的交聯成為復雜的三維網狀結構，具有良好的穩定性和難溶性，一般方法很難將其水解，由此引發羽毛降解方法的研究熱潮。目前常用途徑有物理降解法、化學降解法和角蛋白酶降解法。盡管物理、化學方法研究較早，但存在破壞氨基酸結構、產物單一以及產物穩定性差等缺點。酶法反應條件溫和，環境污染小，降解產物完整多樣，具有應用前景。酶法降解涉及到產酶菌的篩選，酶的分離鑒定和羽毛降解等過程。

1 角蛋白結構及性質

角蛋白是中間絲超家族的重要成員，以α-螺旋和β-折疊進一步構成超螺旋多肽鏈，內部的半胱氨酸二硫鍵作為連接橋形成復雜的交聯網。1930年，Aatbury和他的同事利用高角度的X射線衍射研究角蛋白的分子結構，提出蛋白質肽鏈是折疊的，隨后發現這種折疊就是α-螺旋。他們將羊毛拉伸至原長2倍后發現，角蛋白變為β-折疊模式的裝配。三維結構的分析顯示，角蛋白二級結構主要為α-螺旋和β-折疊，β-折疊的形成和相互作用對于角蛋白的裝配起著重要作用。根據二級結構的組成將角蛋白分為α-角蛋白和β-角蛋白。其中，α-角蛋白多見于脊椎動物上皮，富含大量半胱氨酸殘基，二級結構則由大量α-螺旋構成，分子量為40～70 kDa。β-角蛋白分子量要小很多，在10～20 kDa范圍，富含小側鏈甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸殘基，二級結構幾乎都由β-折疊的片層結構組成，也是角蛋白穩定性高的重要原因。羽毛角蛋白主要為β-角蛋白，通過二硫鍵使各條肽鏈相互交聯，具有良好的穩定性且不易被降解。

角蛋白強度與尼龍相當，其內部的交聯網徑要小于木材纖維。角蛋白的性質與其結構密切相關，它不被胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶降解的原因是具有能抵抗特異性蛋白酶活性的長聚合鏈。角蛋白難溶和難降解的抗性不僅取決于聚合肽的超螺旋結構，還由于半胱氨酸形成的二硫鍵和其它分子相互作用使蛋白機械強度提高。角蛋白的反應活性位點是酰胺鍵、羧基和亞砜基等，當角蛋白濃度很低時，角蛋白分子傾向于形成分子內二硫鍵，使肽鏈不能通過分子間二硫鍵交聯成網，這提示我們可通過控制角蛋白肽鏈的交聯程度改變其難降解的性質。

2 羽毛降解生產角蛋白及類似物

2.1 物理方法

物理法也叫機械法，原理是利用特殊溫度、壓力條件使羽毛水解為可溶性多肽或寡肽混合物，高壓蒸汽可增加角蛋白的溶解性。該法工藝流程簡單，將羽毛除雜、投入反應器后通入蒸汽，得到塊狀蛋白產物后烘干粉碎便可作為動物飼料。近幾年發現，微波法也可用于廢棄羽毛的降解，較傳統物理法有更高的產率，但產物單一，多為復合氨基酸，且研究尚處在實驗室階段。物理方法多會破壞氨基酸分子鍵，產物穩定性差，若作為動物飼料，得到的蛋白粉口味較差，消化率低，限制了物理法的應用范圍。

2.2 化學方法

化學法利用酸、堿或氧化還原劑使羽毛中的角蛋白降解為可溶性蛋白、多肽或游離氨基酸。Kelly等利用Ca(OH)2處理雞羽毛生產動物飼料，反應溫度在150℃，羽毛角蛋白25 min內溶解80%，反應后經碳酸化可回收54%的鈣劑。利用NaOH的堿水解法可產生多種不同肽鏈，增加酰胺鍵和亞砜含量能改變角蛋白的化學性質，堿溶液在65℃反應，2～5 h內可提出68%～82%的水溶性角蛋白，富含中間纖維和中間纖維絲成分，若將NaOH與Na2S聯合溶解羽毛，40℃便能提取出角蛋白。氧化還原劑的使用也可降解羽毛，水、甘油和亞硫酸鈉的組合可降解羽毛產生液體角蛋白，而巰基乙酸等物質的預處理可有效破壞二硫鍵。Schrooyen等選用2-巰基乙醇和尿素共同降解雞羽毛，尿素起蛋白質溶脹作用，采用滲析除去巰基乙醇和尿素后發現，角蛋白多肽出現聚集現象，并且半胱氨酸殘留物氧化形成凝膠，影響了角蛋白溶液的穩定性。改變實驗條件發現在滲析前加入十二烷基硫酸鈉（SDS）可阻止多肽鏈的聚集。但堿法效率不高，產物主要為多肽；酸法會腐蝕設備、污染環境，且復合氨基酸產率不高。酸堿的聯合水解是今后的研究方向。

2.3 角蛋白酶降解法

角蛋白是一種不溶性蛋白，其良好的穩定性是因為半胱氨酸形成的大量二硫鍵使肽鏈相互交聯，選擇降解方法很關鍵。堿水解法或機械處理會破壞氨基酸內部結構，同時消耗大量能量。較好的選擇是利用特異性蛋白酶將羽毛水解。角蛋白酶的應用十分廣泛，可用作羽毛、毛發和膠原蛋白等物質的降解，具有高效的脫毛性；還可降解朊蛋白，用于洗滌劑和熱處理工藝。角蛋白酶可從多種真菌和細菌的培養中得到，酶的來源日趨豐富。

2.3.1 產酶菌的篩選

角蛋白酶的活性取決于生產它的微生物，從芽孢桿菌(Bacillus sp)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和假單胞菌（Pseudomonas）等多種細菌或真菌都已分離出角蛋白酶，部分角蛋白酶只具有降解某些氨基酸的活性，比如在多種微生物中被分離的絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。產酶菌的培養須有羽毛作為底物，將土壤樣品與底物混合放至無菌培養皿中，在28℃下培養，并添加氯霉素抑制細菌生長，沙式瓊脂或燕麥膳食瓊脂的使用可用于產酶菌的純化和鑒定。

在各種微生物中，尤以芽孢桿菌或地衣芽胞桿菌分離出的角蛋白酶最多，發酵培養基組成成分得到了進一步優化，酶最適pH值為8溫度為50℃，但酶活性會被EDTA顯著抑制。最近，Kublanov等以100 mg/l蔗糖、200 mg/l酵母提取物、1 mg/l維生素、1 g/l蛋白胨和2 g/l豬毛為培養基培養一種少見嗜熱厭氧菌，4 d后分離出分子量為150 kDa的罕見絲氨酸蛋白酶，并對酶水解活性進行了表征。

2.3.2 酶活性的鑒定

最初篩選的菌株合成酶可能只具有降解角蛋白部分組分的活性，需要對酶活性進行表征鑒定。先利用膜超濾，羥甲基纖維素，離子交換和葡聚糖凝膠層析等方法純化角蛋白酶，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量。將角蛋白粉、硫酸鹽緩沖液和培養濾液混合放至水浴搖床，各成分的配比因角蛋白酶種類的不同有所差異。反應一定時間后添加乙酸使反應終止。采用分光光度法，以僅缺少三氯乙酸的樣品作為對照，每增長一單位吸收值代表一單位的酶活性。不同反應條件會影響酶活性，比如由弧菌分離出的角蛋白酶適宜在37℃反應，而產自金黃桿菌的蛋白酶在30℃、偏堿性條件下有最高的催化活性。此外，NaCl和十二烷基硫酸鈉(SDS)等化學試劑的添加也會影響酶活性。

2.3.3 酶對羽毛的降解

酶對羽毛的降解既要考慮促進生產蛋白酶的產酶菌生長條件，也要考慮使角蛋白酶具有高催化活性的反應條件。Fakhfakh等將地衣芽孢桿菌RPK培養在含有7.5 g/l雞羽毛，2 g/l的酵母提取物，0.5 g/l NaCl，0.1 g/l MgSO4·7H2O，0.7 g/l KH2PO4和 1.4 g/l K2HPO4的培養基中，37℃下攪拌48 h可使絲氨酸蛋白酶的產量和活性都達到較高水平。Cao等從一種嗜食單胞菌分離出具有羽毛降解活性的角蛋白酶，在pH值7.8和40℃條件下，羽毛得到最大程度的降解，酶的活性可完全被一種絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制，而金屬離子又可提高酶活性。近幾年固定化蛋白酶的利用較廣泛，固定酶可最大限度減少酶的自溶，有利于產物蛋白質或多肽的分離，酶可以被重復利用。Lin等將角蛋白酶固定在孔徑可調的玻璃微珠上，這種分離自地衣芽孢桿菌PWD-1的酶在酸性條件下顯示出更好的熱穩定性和耐受性，7 d后仍有40%的活性。

角蛋白酶的穩定性和活性受溫度、pH值和化學底物影響。甲醇、乙醇和異丙醇等有機溶劑可誘導酶的活性，酶則表現出更高的催化效應，而EDTA抑制酶活性，加入5～10 mmol EDTA會導致30%的酶活性喪失。不同酶的反應速率也有所不同，從金黃桿菌分離出的角蛋白酶具有更快的降解速率。

3 角蛋白的綜合應用

3.1 動物飼料

蛋白飼料的使用可促進動物生長，獲得更好的飼喂效果，目前動物蛋白飼料有豆粕、魚粉和肉粉等，這類飼料蛋白含量高，飼喂效果較好，但價格昂貴，部分需要進口，動物飼料資源的缺乏一定程度上制約著養殖業的發展。角蛋白被認為是一種優質蛋白飼料，對比實驗證明，角蛋白混合物和玉米大豆粉有相似的促生長作用，其豐富的來源和低廉的成本有望解決飼料資源短缺的問題。

3.1.1 飼料制備

羽毛角蛋白飼料的制備經歷了幾個階段，最早以家禽羽毛制成羽毛粉作為動物飼料，但受角蛋白不溶性的影響，其消化率僅為9.6%，遠低于大豆蛋白99.5%的消化率，受限的飼喂效果影響了飼料的大規模應用。后來采用物理方法降解羽毛，利用高溫膨化法對羽毛進行擠壓，產物基本達到飼用要求，但需要在高溫高壓、長時間的特殊環境下操作，會對產物的內部結構造成破壞。隨著羽毛降解研究的深入，角蛋白飼料的生產已從傳統的高壓水解、化學水解等過渡到生物技術處理羽毛制備飼料。

酶法制備是利用特異性角蛋白酶對羽毛進行降解，產物含有可溶性角蛋白、多肽和多種游離氨基酸，經分離純化后制成高蛋白動物飼料，或與糠麩、糟渣等農副產品配合制成復合蛋白飼料。最近發現，角蛋白酶能提高飼料轉化率，在每千克大豆粉和棉籽粉飼料中加入1 g角蛋白酶，可顯著提高氮存留率和淀粉消化率。顯微鏡觀察肉雞小腸證實角蛋白酶能提高絨毛高度與隱窩深度比值，表明小腸消化吸收功能增強，酶和角蛋白有望不經分離用于動物飼料的制備。

3.1.2 飼料營養成分

飼料的營養成分直接影響動物對飼料的適口性，高效蛋白飼料應包含蛋白質、必需氨基酸、脂類和提供礦物質元素的鹽類。蛋白質的供給使動物胴體脂肪減少，瘦肉率提高，賴氨酸可促進肌內脂肪和肌紅蛋白合成，色氨酸具有改善肉質功效，鈣離子參與的肌肉收縮能提高肉的鮮嫩度。飼料蛋白質營養價值常以氨基酸消化率評定，測定指標有糞表觀消化率、回腸表觀消化率（AID）和標準化回腸消化率（SID），飼料成分的搭配可參考美國NRC、英國ARC給出的動物營養需要和飼養標準。

角蛋白飼料營養搭配合理，膨化羽毛后粗蛋白含量在85%以上，使蛋白供應不會低于臨界蛋白水平而使動物采食量減少。羽毛降解產物含有鈣、磷等生長必需礦物質元素，可減少在飼料中人工添加鹽類帶來的環境污染。賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和色氨酸作為主要限制性氨基酸影響動物生長代謝，必需氨基酸的平衡搭配是保證動物正常生長的重要因素，當配比失衡時動物甚至會選擇不含蛋白的飼料進食。角蛋白飼料本身含有多種必需氨基酸，對比研究表明，羽毛酶解產物中賴氨酸和甲硫氨酸等氨基酸含量要顯著高于NaOH的堿法降解產物，經簡單的后加工流程制得回報率高的角蛋白飼料。

3.1.3 飼料的喂養

動物的日糧供應會影響生長發育，應根據其體重變化分為不同的飼養階段。Noreen等用羽毛粉、豆粕和30%的玉米麩質飼喂重1.23 g的魚苗，以占魚苗濕重4%的飼料添加量進行6周實驗，每天早上8點和下午2點分兩次提供飼料。結果顯示羽毛粉組魚苗重量為（1.88±0.04）g，低于玉米麩質組的（2.07±0.01）g，可能是羽毛粉僅含45%的粗蛋白影響了飼喂效果。飼料的喂食狀態會影響動物的適口性，粉狀或微粒狀的蛋白飼料與片狀或塊狀飼料雖然消化率相似，但對動物自然采食量有不同影響。對于動物的飼養，可利用其屠宰、加工產生的大量下腳料和角蛋白飼料組成復合飼料，在節約成本的同時獲得良好的飼喂效果。

3.1.4 飼料安全問題

目前飼料制備常添加抗菌藥和生長促進劑以獲得更好的飼喂效果，但對動物和人類健康帶來安全隱患。飼料加工、運輸過程中容易引起飼料霉變，黃曲霉等霉菌的產生會使動物中毒，很多飼料原料本身含有毒物質，棉籽餅粉中含有1%左右的有毒棉酚，飼喂未經脫毒的餅粉會引起動物中毒。角蛋白飼料不含抗營養因子，簡化了原材料的預處理流程，飼料均衡的營養搭配可減少添加劑的摻入量，在加工運輸中不易導致飼料霉變，具有更高的安全性，但在羽毛加工飼料前一定對羽毛進行高溫預處理，旨在殺滅因羽毛收集過程中控制不嚴格混入的病死動物羽毛所攜帶的致病源。

3.2 醫藥行業

將羽毛角蛋白降解為可溶性蛋白質后，可利用蛋白質中氨基與其它高分子材料的基團相連接，構成角蛋白高分子聚合物。由于可溶性蛋白質的存在，聚合物具有優良的生物降解性能，可應用于醫藥制品、人工支架或高吸收材料的醫用敷料制備。利用角蛋白制備的生物凝膠用于創傷相關的神經缺損修復，作用機制是通過激活雪旺氏細胞介導穩定高效的神經再生反應，擴大了角蛋白在醫學方面的應用范圍。

3.3 優良復合材料

角蛋白可作為纖維素角蛋白復合材料的組分，較一般纖維素材料有較小的吸附性，較高的吸濕性和較小的潤濕角。角蛋白海綿適合作為良好支撐物用于細胞培養，和傳統基于聚苯乙烯的細胞培養底物相比，這種支撐物更能改善細胞生長代謝水平。

3.4 食品行業

二硫鍵和氫鍵的交聯賦予角蛋白很強的成膜能力，可作為外包膜用于食品包裝。蛋白膜堅固、柔韌、無異味，可減少廢棄包裝材料對環境的危害，但需要加入一些增塑劑，如甘油、山梨醇等以提高蛋白膜的熱學和力學等性能。

4 小結

角蛋白飼料的應用對于動物飼料供給具有重要意義，但角蛋白的難溶性會影響動物飼喂效果，需要降解羽毛得到水溶性角蛋白或多肽。目前，液體角蛋白的研究不夠深入，不能滿足大規模生產，制約工業化生產的瓶頸是有效的羽毛降解方法。物理法因其特殊的高溫高壓環境，會破壞肽鏈或氨基酸內部結構，降解產物的應用范圍受到制約；化學法得到的降解產物穩定性較差，需進行化學修飾后才能被進一步利用。相較其它方法，酶法水解羽毛具有反應條件溫和、產物特異性高和環境污染小等優點，降解產物更適合高蛋白飼料的制備。相信隨著更多產酶菌的篩選會分離出適宜的角蛋白酶，降解獲得性能優良的可溶性蛋白或多肽，更廣泛地應用到飼料、復合材料、生物制品、醫藥等行業。

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