微生物限度檢查法對丸劑的驗證

隋玲

本文通過理論分析對丸劑的微生物限度檢查方法的驗證過程與結果的影響因素。衡量藥品合格與否的一項重要指標是藥品的微生物限度是否符合要求。微生物限度檢查法是檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括染菌量及控制菌的檢查，是判斷生產(chǎn)單位所用的藥用原輔料、設備、工具、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作者衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)。微生物限度檢查操作繁瑣，要求嚴格，許多干擾因素都會造成檢驗結果誤差。

1 驗證方法

1.1 供試液的制備 《中國藥典》［1］規(guī)定“當供試品有抑菌活性時，應消除供試液的抑菌活性，再依法檢查”。大多數(shù)情況下，僅從其處方和生產(chǎn)工藝上難以判別檢品是否有抑菌活性，此時的供試液制備的特殊方法，對檢驗員就無操作性可言?！吨袊幍洹芬?guī)定，后述細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)和控制菌驗證檢品有無抑菌活性是檢查方法的驗證中的一個重要方面，當建立藥品的微生物限度檢查方法時，應進行方法驗證。因此，為避免檢驗員操作時的邏輯錯誤，可將具有抑菌活性的供試品的供試液制備的特殊方法列入計數(shù)方法和控制菌檢查驗證的環(huán)節(jié)中。

1.2 驗證 《中國藥典》明確規(guī)定，驗證計數(shù)方法和控制菌檢查方法“若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結果時，計數(shù)方法和控制菌檢查方法應重新驗證”。但因“藥品的組分”和“原檢驗條件”這兩個改變因素，驗證標準均未進一步明確。①“藥品的組分”從字義上理解有二層含義，一是藥品原料中的種類，從藥品標準及批準文號方面考慮原料的種類是不會改變的，否則該檢品應視為假藥;二是原料的來源，當原料的來源發(fā)生變化時，只有該檢品的生產(chǎn)企業(yè)知曉，而除此之外的檢測機構卻不知曉，因而對“藥品的組分”的改變，實際上也無可操作性;②對不同的檢測機構而言“原檢驗條件”一定不同，因此，不同的檢測機構的檢驗方法不全一致;③在方法驗證條件中，對同一品種不同生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品，同一品種同一生產(chǎn)企業(yè)不同時段生產(chǎn)產(chǎn)品，標準均未作明確的具體規(guī)定，這也使檢驗機構在作方法驗證時，不便操作。筆者認為，對何時作計數(shù)方法和控制菌檢查方法作驗證，《中國藥典》應更進一步明確、細化。此外，還應將微生物檢測實驗室的有關設備、儀器的驗證，檢驗中標準菌種使用、保存與管理的驗證，消毒劑的使用及效力的驗證，培養(yǎng)基、緩沖液、稀釋液和試劑的驗證，所使用滅菌方法的驗證等驗證內(nèi)容納入微生物限度檢查法的驗證范圍，方能全面完善檢測方法的可行性。

2 影響因素的分析

2.1 操作環(huán)境的影響 微生物限度檢查應有單獨的無菌室，環(huán)境潔凈度不應低于10000級，局部潔凈度為100級，每次操作前用0.1%新潔爾滅或其他適宜消毒液擦拭操作臺及可能污染的死角，然后啟動層流凈化裝置，同時用紫外殺菌燈照射30 min。無菌室內(nèi)應固定存放乙醇燈、火柴、剪刀、碘伏棉等。應在半無菌室進行菌種處理和微生物鑒別，嚴禁在微生物檢查用潔凈室操作，否則，將可能造成試驗室環(huán)境污染或菌種之間的交叉污染。

2.2 設備及用具的影響 凡操作過程中所用的器皿均應洗滌干凈，用牛皮紙包扎嚴密，滅菌。經(jīng)高壓蒸汽滅菌的物品取出時切勿立即置冷處，避免因急速冷卻，使滅菌物品內(nèi)蒸汽冷凝造成負壓易染菌，取出后應置恒溫培養(yǎng)箱中烘干，待用。各種恒溫恒濕培養(yǎng)箱除定期檢定外，還應每天觀察箱內(nèi)溫度及濕度波動的范圍;高壓蒸氣滅菌器在每次使用時，應放置必要的監(jiān)視指標，據(jù)指示卡的變色情況，判斷是否在設定的溫度與壓力條件下達到滅菌效果?？傊瑸楸ＷC各種器械及設備正常使用均應對其有定期計量與檢定記錄。

2.3 供試液制備過程的影響 當建立藥品的微生物限度檢查法時，為保證檢驗質(zhì)量，應先進行方法的驗證，以確認供試品在該試驗條件下無抑菌活性或抑菌活性可以忽略不計。供試品檢驗全過程必須符合無菌技術要求。供試液稀釋及注皿時應振搖后取均勻的供試液，如取上清液或沉淀物對試驗結果必然有影響。供試品、稀釋劑、培養(yǎng)基都要定量加入，這樣可使檢查標準化，還可控制試驗結果，千萬不能估計取量。

2.4 菌落計數(shù)誤差 菌落計數(shù)一般是從平板的背面直接以肉眼點計，計數(shù)時應仔細觀察、準確判斷，平皿邊緣和瓊脂內(nèi)生長的菌落不要漏計，同時應注意細菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落與供試品顆粒、沉淀物、氣泡、油滴等的鑒別。培養(yǎng)基注皿后由于供試品稀釋液中常含有不溶性原料、輔料，有可能產(chǎn)生沉淀物，這些有形物很難與菌落相鑒別，為了有利于菌落計數(shù)，可在操作時將適宜稀釋級的稀釋液多增加注皿1～2個，注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱(勿凍結)中，在計數(shù)菌落時作為對照。在規(guī)定的培養(yǎng)條件下，應嚴格遵守培養(yǎng)時間，但菌落生長呈蔓延趨勢者，細菌點計需在24 h，霉菌點計需在48 h進行初步點計，最終結果細菌以培養(yǎng)48 h的菌落數(shù)報告，霉菌、酵母菌以培養(yǎng)72h的菌落數(shù)報告。

2.5 菌種的制備及保存 菌種是活的微生物，在菌種的使用保藏過程中需定期傳代，且防止變異，微生物檢查所用菌種的不得超過5傳代，應有專人負責，專用冰箱保存，在應用前，應對菌種的純度和特性進行確認。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(二部)．北京:化學工業(yè)出版社，2005，93:101．