氨基酸分析儀測定魚粉中的氨基酸

林 淼 趙志輝 雷 萍

近年來，隨著我國飼料工業的迅猛發展，魚粉的需要量逐年增加，魚粉的質量問題越來越引起飼料行業、養殖業的重視。魚粉是水產飼料的主要蛋白源，尤其含有動物生長所必需的氨基酸，含量豐富且配比合理，在飼料、養殖行業中起著不可代替的作用。由于用量大，價格高，有些商家在魚粉中摻雜使假、以次充好，使魚粉質量參差不齊，給市場造成了一定的混亂[1-2]。摻假、摻雜魚粉中往往是摻入兩種或兩種以上雜質，并且有些魚粉因加工工藝不當造成腐敗，這給魚粉品質分析帶來了一定的困難。因此，有必要建立一個有效的手段對魚粉中的氨基酸進行定量分析。目前，只有少數幾篇文獻涉及到魚粉的定量分析。對于氨基酸的分析大多采用液相色譜[3]、氣相色譜-質譜聯用[4-5]、毛細管電泳[6]、凱氏定氮法[7]和光譜法[8-9]等。然而，這些方法或試劑費用昂貴，或分離效率低，有些方法還不能同時測定多種氨基酸。運用氨基酸分析儀可解決上述問題，同時方法操作簡便，重現性好，靈敏度高。

1 實驗部分

1.1 方法原理

氧化水解法是將魚粉中的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等)用過甲酸氧化，然后進行酸解，再經離子交換色譜分離、測定[10]。脯氨酸在570 nm處有最大吸收峰，除脯氨酸外，其他各氨基酸均在440 nm有最大吸收峰。因此，在570 nm檢測波長計算脯氨酸含量，而在440 nm檢測波長計算其它各氨基酸含量。

1.2 試劑與材料

1.2.1 試劑

過甲酸溶液：將30%過氧化氫與88%甲酸按1：9(體積比)混合，于室溫下放置1 h，置冰水浴中冷卻30 min(臨用前配制)；48%氫溴酸；6.0 mol/l鹽酸溶液：將優級純鹽酸與水按1：1(體積比)混合；茚三酮溶液；流動相：參照表1。

表1 流動相梯度洗脫

除特殊說明，所用試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2.2 氨基酸混合標準儲備液

含天門冬氨酸、蘇氨酸等17種常規蛋白水解液分析用層析純氨基酸，各組分濃度C(氨基酸)=100 nmol/ml。

1.3 儀器與設備

Aminosys A200自動氨基酸分析儀系統：配有微型光度檢測器、超聲波提取器、溶劑微孔過濾器帶0.22 μm水相濾膜、渦旋振蕩器、水浴鍋、真空泵。

1.4 實驗方法

1.4.1 試樣制備

稱取魚粉0.5 g左右(精確至0.000 1 g)，置于20 ml濃縮瓶或濃縮管中，于冰水浴中冷卻30 min后加入已經冷卻的過甲酸溶液2 ml，加液時需將樣品全部潤濕，但不要搖動，蓋好瓶塞，放入55℃水浴反應15 min，直至全部樣品氧化成淺土黃色；向濃縮管中加入氫溴酸0.3 ml，振搖，使反應終止；抽真空；加入約15 ml鹽酸溶液，搖勻，超聲使其溶解，再抽真空，封口，置恒溫箱中，（110±1）℃下水解 22～24 h；取出濃縮管，冷卻，用水將內容物定量地轉移至50 ml容量瓶中，定容；過0.22 μm濾膜后即可上機。

1.4.2 色譜分析

色譜條件：氨基酸柱(安米諾西斯公司生產)；柱溫：采用程序升溫，58 ℃(0～38 min)、70 ℃(38～43 min)、75℃(43～75 min)和58℃(75～82 min)；流動相流速：0.2 ml/min；檢測波長：440 nm/570 nm雙波長同時檢測；反應器溫度：115℃；分別取標準溶液及試樣20 μl進樣。根據保留時間及標準加入法定性，試樣峰面積與標準峰面積比較定量。

2 結果與討論

2.1 氨基酸的色譜分析

實驗所測定17種氨基酸標樣色譜圖見圖1。0～64 min圖譜顯示440 nm檢測結果，64 min后顯示570 nm檢測結果。從圖1可看出，17種氨基酸在選定的分離條件下可以達到很好的分離效果。

2.2 精密度和準確度實驗

在上述優化條件下，將濃度均為100 nmol/ml的氨基酸混合標準溶液連續進樣9次，峰面積的相對標準偏差(RSD)按出峰次序分別為3.3%(胱氨酸)、4.2%(蛋氨酸)、2.3%(天門冬氨酸)、4.1%(蘇氨酸)、3.7%(絲氨酸)、2.8%(谷氨酸)、2.4%(脯氨酸)、2.4%(甘氨酸)、4.1%(丙氨酸)、3.4%(纈氨酸)、1.9%(異亮氨酸)、2.8%(亮氨酸)、4.3%(酪氨酸)、1.9%(苯丙氨酸)、3.2%(組氨酸)、2.7%(賴氨酸)、2.3%(精氨酸)，實驗結果表明，在上述優化條件下本實驗方法是可行的。

圖1 氨基酸標準譜圖

2.3 方法線性方程、檢出限及回收率實驗

對氨基酸的混合標樣進行測定，得出該方法的檢出限、線性范圍，所得的數據見表2。由表2可知，該方法對17種氨基酸的檢測具有較低的檢出限、較寬的線性范圍和較高的回收率，較高的回收率也說明了用該方法檢測魚粉中的氨基酸所得到的數據是準確可靠的。

表2 17種氨基酸的線性回歸方程、相關系數、檢出限及回收率

圖2 國產魚粉中氨基酸標準譜圖

3 魚粉中氨基酸的測定

用所建立的方法檢測了4家國內不同廠家魚粉及2家進口魚粉，國內魚粉和進口魚粉各選擇一個有代表性的典型樣品圖譜見圖2、圖3，6家樣品的分析結果見表3(其中樣品1～4為4家國內不同廠家魚粉，樣品5～6為進口魚粉)。

4 結論

當前飼料企業步履維艱，如果不控制好原料的質量，特別是昂貴的動物性蛋白飼料——魚粉，后果將是嚴重的。魚粉是飼料工業的重要原料，其水解液中氨基酸的測定對其營養評價和飼料配制具有重要意義，所以使用魚粉的飼料企業只有嚴把質量關，才能控制成品的質量，并使養殖戶用上優質的飼料。文中使用氨基酸分析儀測定魚粉中的氨基酸的方法，快速、簡便和靈敏，所得圖譜為魚粉的質量控制提供了直觀、可靠的科學佐證。

圖3 進口魚粉中氨基酸標準譜圖

表3 魚粉中氨基酸的分析結果(n=3)（%）

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