一株飼用枯草芽孢桿菌CCAM 080032固態發酵工藝的研究

付小猛 趙述淼 梁運祥 葛向陽

因抗生素的濫用而導致的毒性殘留、耐藥性等問題已引起人們的廣泛關注。尋找安全、無毒的替代品迫在眉睫。作為抗生素的替代品之一，芽孢桿菌制劑能抑制腸道腐敗菌的生長，促進動物生產，并且能形成芽孢，可以耐受高溫和具有良好的貯存性能，一直都是畜牧業科研和生產人員關注的焦點[1]。

芽孢的形成受環境因素的影響，不同菌種形成芽孢的條件不同?？莶菅挎邨U菌的芽孢較其它營養體細胞易保存，存活率高，是制備枯草芽孢桿菌制劑的理想存在形式，而制劑中的芽孢含量是影響產品應用效果的關鍵因素[2]。目前,芽孢桿菌制劑的生產方式有兩種：液態發酵和固態發酵。液態發酵易實現純培養和工業化生產，但對設備要求高，生產工藝復雜，且環境污染嚴重；而固體發酵采用的原料一般是廉價的農副產品(如麩皮、谷殼等)，采用的設備也較液體發酵簡單，生產成本大大低于液體發酵。因此，選取合適的生產方式，實現低成本、高產率，滿足畜牧業生產發展的需要，是一個亟待解決的課題[3]。本課題的研究目的就是通過對枯草芽孢桿菌固態發酵工藝的優化，以期獲得較佳產孢條件，為飼用枯草芽孢桿菌制劑的產業化生產提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CCAM 080032，本實驗室保藏。

1.2 培養基

液體種子培養基：LB液體培養基；平板計數培養基：LB固體培養基；固體發酵培養基原料及試劑：麩皮、稻草粉、葡萄糖、胰蛋白胨、NH4NO3、KH2PO4等。

1.3 種子液的制備

從活化好的枯草芽孢桿菌試管斜面接一環菌種至液體種子培養基，置37℃、200 r/min控溫搖床下培養17 h。

1.4 固態培養

根據試驗配方稱取固體發酵培養基原料，裝料量為40 g，加入適當蒸餾水，121℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫后，以接種量為5%接入種子液，在37℃培養48 h，然后60℃烘干、粉碎、計芽孢數。

1.5 芽孢計數方法

按平板菌落計數法[4]計算芽孢數：準確稱取粉碎后發酵物料10 g，放入盛有90 ml無菌生理鹽水的三角瓶中制成菌懸液，80℃水浴15 min殺死營養體，然后將菌懸液稀釋至10-7～10-8，取100 μl均勻涂布到LB平板上，于37℃倒置培養24 h，進行菌落計數。

1.6 培養基優化

1.6.1 培養基固體基質的選擇

用膨潤土、玉米芯粉、稻草粉、谷殼、豆粕分別與麩皮以 1： 3（w/w）混合，料水比為 1： 1.5，按初始條件進行發酵，發酵結束測定芽孢產量，確定最適的基質成分。確定基本組成后，再按比例配制基質，確定兩種基質的最佳配比。

1.6.2 外加碳源優化

分別按50 g/kg的濃度添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉到培養基中。其他條件保持一致，37℃發酵48 h后測定芽孢產量。確定最適外加碳源的種類。

1.6.3 外加氮源優化

按表1所示比例分別添加硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、尿素、胰蛋白胨、酵母抽提物到含50 g/kg葡萄糖的基礎培養基中。其他條件保持一致，37℃發酵48 h后測定芽孢產量，確定最適外加氮源的種類。

表1 外加氮源對芽孢產量的影響

1.6.4 培養基的正交設計試驗

依據之前的試驗結果，且根據磷酸鹽是細菌細胞壁合成必需的營養元素，在固體發酵中可以促進菌體生物量的增加[5]，選擇葡萄糖、胰蛋白胨、硝酸銨以及磷酸二氫鉀四個因素，采用正交設計表L9（34），以確定最佳培養基配方。

1.7 培養條件優化

1.7.1 發酵時間的確定

將枯草芽孢桿菌CCAM 080032在37℃下進行固態培養，每12 h取樣測定芽孢產量，以確定最適的發酵時間。

1.7.2 發酵溫度的選擇

分別在 30、34、37、40、45 ℃的溫度下，發酵 48 h后測定芽孢產量，確定最適的發酵溫度。

1.7.3 料水比的確定

通過控制添加的蒸餾水的量，使培養基料水比分別為 1： 1、1： 1.25、1： 1.5、1： 1.75，其他條件保持一致，37℃發酵48 h后測定芽孢產量，以確定最佳的初始料水比。

2 結果與分析

2.1 培養基優化

2.1.1 培養基固體基質的選擇

在固體發酵中，基質的選擇非常關鍵?；|不僅能為菌體的生長提供必需的底物，還可以影響微生物發酵過程的傳質、傳熱及微生物的代謝功能等。不同的基質，由于其疏松程度不一樣，氧和熱量的傳遞效率也不一樣。固態發酵培養基的發酵基質一般為透氣性較好、營養豐富的麩皮。在發酵過程中，為了增加培養基的透氣性，可以添加適量的其他基質。在供試的5種固體基質中，稻草粉可以顯著提高芽孢產量，芽孢產量達到5.67×1010CFU/g干物料（見圖1）。

圖1 不同固體基質對芽孢產量的影響

確定麩皮和稻草粉為固體發酵的基質后，進一步優化其配比。結果表明（見圖2），稻草粉的含量過高或過低都不利于芽孢產量的提高，稻草粉和麩皮的最適比例應控制在2：8。此時，芽孢產量達到5.90×1010CFU/g干物料。

2.1.2 外加碳源優化

分別按50 g/kg的濃度添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉到培養基中。其他條件保持一致進行發酵，結果如圖3所示，以葡萄糖為外加碳源時枯草芽孢桿菌的芽孢產量明顯高于蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉，最高可達到6.23×1010CFU/g干物料。說明該枯草芽孢桿菌生長的最適碳源為葡萄糖。

圖2 麩皮與稻草最佳比例的確定

圖3 外加碳源對芽孢產量的影響

2.1.3 外加氮源優化

按表1所示比例分別添加 NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、(NH2)2CO、胰蛋白胨、酵母抽提物到含50 g/kg葡萄糖的基礎培養基中。其他條件保持一致進行發酵，結果如表1所示，以NH4NO3和胰蛋白胨為外加氮源時該枯草芽孢桿菌的芽孢產量有所提高，分別達到 6.53×1010CFU/g 和 6.93×1010CFU/g，這說明此菌既能利用有機氮源也能利用無機氮源，因此，以NH4NO3和胰蛋白胨組成的復合氮源為其最適的外加氮源。

2.1.4 培養基的正交設計試驗

依據之前的試驗結果，選擇葡萄糖、胰蛋白胨、NH4NO3以及KH2PO4四個因素，采用正交設計表L9（34），以確定最佳培養基配方。從極差分析結果可以看出，影響芽孢產量的主要因素排序為：胰蛋白胨＞NH4NO3＞葡萄糖＞KH2PO4。從正交試驗得到外加營養物質最適的組分含量為葡萄糖50 g/kg、胰蛋白胨20 g/kg、NH4NO315 g/kg、KH2PO410 g/kg。采用最優的一組培養基進行發酵，芽孢產量可達到7.26×1010CFU/g。

表2 正交試驗L9（34）測試結果

2.2 培養條件的優化

2.2.1 發酵時間的確定

發酵周期也是一個很重要的試驗指標，因為縮短發酵周期就意味著降低能耗，節約生產成本，增加生產批次[6]，將枯草芽孢桿菌在37℃下進行固態培養，每12 h取樣測定芽孢產量。結果如圖4所示，菌株在培養12～48 h內，芽孢產量呈明顯上升趨勢，48 h時達最大值，然后隨著培養時間的延長(48～60 h)，芽孢產量不再增加甚至下降，而且，在生產實踐中隨著培養時間的延長對能源的消耗和污染雜菌的機會都會增加，因此，最適的發酵時間為48 h，此時芽孢產量最高，為 6.67×1010CFU/g干物料。

圖4 發酵時間對芽孢產量的影響

2.2.2 發酵溫度的選擇

在 30、34、37、40、45 ℃的發酵溫度下，發酵 48 h后測定芽孢產量，結果如圖5所示，溫度過高時培養基水分迅速喪失，而溫度過低導致菌體生長緩慢，在37℃時芽孢產量達到最大，為6.95×1010CFU/g。因此，該菌株最適生長溫度為37℃。

圖5 溫度對芽孢產量的影響

2.2.3 料水比的確定

固態發酵最大的特點就是無游離水，因而底物含水量的變化，對微生物的生長及代謝能力會產生重要的影響[7]。適宜的初始含水量，有助于菌體吸收培養基的營養物質和氧的傳遞，從而促進菌體的生長繁殖。結果如圖6所示，水分過高或過低都會導致芽孢產量的下降，而最適的料水比為1：1.5，此時芽孢產量達到 7.9×1010CFU/g。

圖6 料水比對芽孢產量的影響

3 討論

研究結果表明，固體培養基的成分和發酵條件（如發酵時間、溫度及料水比等）都是影響芽孢形成和生物量的重要因素。通過單因素試驗及正交試驗方法，確定了枯草芽孢桿菌CCAM 080032的最優培養基為：稻草粉：麩皮2：8、葡萄糖50 g、胰蛋白胨20g、NH4NO315g、KH2PO410g、H2O1500g，在 37 ℃培養 48 h后，芽孢產量可達到7.90×1010CFU/g。

近年來，枯草芽孢桿菌作為飼料微生態制劑在畜禽養殖中受到越來越廣泛的應用，而通過優化培養基和培養條件提高其芽孢產量是降低生產成本的重要手段。張志焱等[8]通過優化固態發酵工藝，最終使枯草芽孢桿菌的活菌數達到460億個/g；而Chen等[9]、郭小華等[10]通過液態深層發酵獲得的芽孢產量分別為1.52×1010CFU/ml和3.10×109CFU/ml。與前人的研究結果相比，本研究所采用的固態發酵工藝的生產成本更低、產量更高，具有較大的優勢。

與固態發酵相比，液態發酵從實驗室規模到工業規模的發酵放大以及限制因素的檢測和控制相對容易，而固態發酵在傳質、傳熱方面還缺乏全面的、詳細的研究[11]。因此，固態發酵的實驗室小試和工業化生產之間的條件控制有很大的差異，如何改進生產中的發酵設備及發酵條件，使之實現工業化生產是下一步迫切需要解決的問題。

[1]Hong H A,Le H D,Cutting S M.The use of bacterial spore formers as probiotics[J].FEMS Microbiol.Rev.,2005,29:813-835.

[2]宋卡魏,王星云,張榮意.培養條件對枯草芽孢桿菌B68芽孢產量的影響[J].中國生物防治,2007,23(3):255-259.

[3]谷春濤,薩仁娜,佟建明.地衣芽孢桿菌TS-01固態發酵培養基的優化[J].微生物學通報,2004,31(4):53-56.

[4]趙述淼.豬源益生芽孢桿菌的分離篩選與應用研究 [D].華中農業大學,2009.

[5]陳洪章，徐建.現代固態發酵原理與應用[M].北京：化學工業出版社，2004：37-39.

[6]崔京春,吳俊罡,劉吉華,等.枯草芽孢桿菌發酵過程的優化[J].飼料工業,2004,7:52-55.

[7]張錦亮.固體發酵技術應用的研究進展[J].重慶科技學院學報(自然科學版),2005,7:64-66.

[8]張志焱,徐海燕,楊軍方.枯草芽孢桿菌固體發酵培養基的優化[J].飼料博覽,2005,09:34-36.

[9]Chen Z M,Li Q,Liu H M,et al.Greater enhancement of Bacillus subtilis spore yields in submerged cultures by optimization of medium composition through statistical experimental designs[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2010,85:1353-1360.

[10]郭小華,陸文清,鄧萍,等.益生枯草芽孢桿菌MA139增殖培養基的優化[J].中國農業大學學報,2006,11(3):41-46.

[11]孫森,宋俊梅,張長山.固態發酵技術的研究應用現狀[J].中國食品添加劑,2007(4):54-58.