毛細管電泳/柱端安培檢測血清中谷氨酰胺

劉大星，王修德，劉延秋

谷氨酰胺（glutamine，Gln）是一種具有特殊營養作用的“條件必需氨基酸”[1]，作為體內含量最豐富的氨基酸，體內谷氨酰胺代謝的恒定對許多疾病的發生與發展有密切聯系[2]?？焖俣行У販y定血中的谷氨酰胺對于谷氨酰胺代謝有關疾病以及臨床腸內外營養研究等方面具有重要意義。目前測定谷氨酰胺常用的方法有液相色譜法[3,4]、氨基酸自動分析儀法、紙層析法[5]、毛細管電泳法[6～8]等。 其中毛細管電泳技術以其高效、快速、靈敏、低耗等優點在氨基酸分析中得到快速發展。但目前國內外毛細管電泳技術測定谷氨酰胺的檢測法多采用紫外吸收法[8]和激光誘導熒光法[7]，這些檢測法存在靈敏度低或儀器昂貴等缺點。而電化學檢測法與上述兩種檢測法相比，具有質量檢出限低、線性范圍寬、選擇性好、設備簡單、價格低廉、高效快速等優點[9]。本文采用毛細管電泳/柱端安培檢測系統，選用萘二羧基醛（DNA）作為柱前衍生劑，研究了谷氨酰胺分離與檢測情況，確定了最佳實驗條件，并進行了人血清中谷氨酰胺分離檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 83-2.5型自動新伏安儀（閩東分析儀器廠）；3086型X-Y記錄儀（四川儀表四廠）；高壓電源及JF-01型微電流伏安儀（山東省化工研究院與山東大學聯合研制）；碳纖維（山東大學碳纖維研究中心）。碳纖維工作電極（制作方法同文獻[10]）。 彈性石英毛細管（30 μm i.d.，360 μm o.d.；J&W Scientific incorporated，USA）。L-谷氨酰胺（第二軍醫大學政翔科技實業服務部化學試劑研究室，層析純），NDA（Fluka公司，純度≥99%），其它試劑均為分析純，實驗用水均為亞沸蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 循環伏安法 在微型電解池中移入1 ml緩沖液，將柱狀碳纖維束工作電極插入溶液中，接通電解池，記錄底液的伏安曲線，加入待測試劑，混勻后記錄樣品的循環伏安曲線。

1.2.2 毛細管區帶電泳/柱端安培檢測 選好一根長度合適的毛細管，高壓電源正極與毛細管進樣端插入同一緩沖液池中，負極與毛細管出口端的緩沖液池連通，與充滿電泳緩沖液的毛細管構成回路，形成毛細管區帶電泳分離系統。調節三維工作臺上的操作器，在顯微鏡下把工作電極對準毛細管的出口。為避免外界干擾，毛細管出口端的三電極檢測系統放入屏蔽盒內，屏蔽盒接地。高壓電源負極與伏安分析儀的輔助電極相連并接地。向檢測池中注入電泳緩沖液，導通高壓回路與檢測系統，選擇好合適的工作電勢，加高壓，20 min后毛細管中電流趨于穩定，開始電滲進樣，電泳分離檢測。柱端安培檢測器構造同文獻[11]，本實驗中所有電勢值均相對于飽和甘汞電極。

2 結果與討論

2.1 谷氨酰胺與NDA在CN-存在下衍生產物的伏安特性 在室溫下，在pH＝9.7的Na2B4O7－NaOH緩沖液中，在2.70×10-3mol/L CN-存在下，9.00×10-4mol/L谷氨酰胺與2.70×10-3mol/L NDA的衍生化反應產物在碳纖維電極上有良好、穩定的氧化響應，峰電勢約為0.63 V。衍生化反應時間在0.5～8h所得的循環伏安圖的峰電流值最大且不變；在不同pH的緩沖液中谷氨酰胺進行衍生化反應，在pH＝9.7時衍生物有一最大峰電流。因此選擇柱前谷氨酰胺與NDA和CN-衍生化反應的條件是：pH＝9.7的Na2B4O7－NaOH緩沖液，反應時間為30min。

2.2 毛細管區帶電泳/柱端安培檢測谷氨酰胺最佳條件

2.2.1 緩沖液的pH值 在pH＝9.7左右，用Na2B4O7－NaOH緩沖體系選擇了5個pH值，研究谷氨酰胺衍生產物的毛細管區帶電泳/柱端安培檢測情況。隨pH增加，衍生反應產物的遷移時間tm、柱效N隨pH增加而減小，而峰電流ip在pH=9.9時有一最大值。綜合考慮緩沖液pH對遷移時間tm、柱效N、峰電流ip的影響，本文選擇pH為9.7的Na2B4O7－NaOH緩沖液，此時峰電流ip值較大，柱效N值較高，遷移時間tm較短。

2.2.2 分離電壓 隨分離電壓Vs的增大，遷移時間tm減小。當Vs=20 kV時，峰電流ip和柱效N均有最大值，故選擇分離電壓為20 kV。此時峰電流、柱效最大，遷移時間較短,基線平穩，峰形好。

2.2.3 檢測電勢 在0.95～1.10 V隨檢測電勢Ed的增加，ip值迅速增大，當檢測電勢超過1.10 V時，峰電流ip值基本不再隨檢測電勢Ed的變化而變化。由于檢測電勢過高，基線噪音較大，應盡量選擇較低的檢測電勢，故本文選擇的檢測電勢為1.10 V。此時檢測靈敏度高，測量重現性好，且基線噪音較小，峰形好。

2.2.4 緩沖液濃度 隨緩沖液濃度的增加，谷氨酰胺衍生物的遷移時間tm延長，柱效N呈上升趨勢。峰電流ip開始隨緩沖液濃度的增加而加大，當濃度達到 2.19×10-3mol/L Na2B4O7－9.39×10-4mol/L NaOH時峰電流ip值達到最大值后緩慢下降。無其它氨基酸干擾時，選擇該濃度的緩沖液能得到低的檢測限。但血清中的酪氨酸（Tyr）干擾谷氨酰胺的測定，在此濃度的緩沖液中，谷氨酰胺與酪氨酸不能分開（圖1-1）。為提高柱效，增加了緩沖液的濃度， 在 2.00×10-2mol/L Na2B4O7－8.57×10-3mol/L NaOH緩沖液中，雖然谷氨酰胺的峰高有所降低，峰變寬，但卻可以使谷氨酰胺與酪氨酸很好地分離（圖1-2），分離度為2.0。所以在測定血清中谷氨酰胺時，本研究選擇的緩沖液為：2.00×10-2mol/L Na2B4O7－8.57×10-3mol/L NaOH。

圖1 谷氨酰胺、酪氨酸衍生產物電泳圖

2.3 分析應用

2.3.1 重現性、檢測限和線性范圍 對5.00×10-5mol/L的谷氨酰胺衍生產物測定8次，遷移時間tm、峰電流ip的相對標準偏差分別為2.2%和3.1%。對1.00×10-6mol/L的谷氨酰胺衍生產物進行毛細管區帶電泳/柱端安培檢測，得到高于基線3倍的響應值，因此得到信噪比S/N=3時谷氨酰胺的濃度檢測限為1.0×10-6mol/L，質量檢測限為1.08×10-15mol/L（1.08 fmol）。谷氨酰胺的線性范圍為 1.00×10-6mol/L～1.00×10-4mol/L，斜率為 1.1 pA/μmol·l，截距為0.27 pA，線性回歸系數為0.999 8。

2.3.2 人血清中谷氨酰胺的測定 取人血清200 μl，加99%的乙醇600 μl，立即在旋渦振蕩器上充分混合振蕩，置4℃冰箱中10min后，1500×g離心15min除去血清中的蛋白，取上清液備用。取去除蛋白的血清 40 μl，分別加入緩沖液 900 μl，0.01 mol/L CN-30 μl和 0.01 mol/L NDA 30 μl， 反應 30 min 后進行毛細管區帶電泳/柱端安培檢測，得到人血清毛細管區帶電泳圖（圖2）。用標準加入法測得人血清中谷氨酰胺的含量為619 μmol/L?；厥章蕿?5%～103%。

圖2 血清中谷氨酰胺毛細管電泳圖其余實驗條件同圖1-2

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