重組人生長激素對大鼠膽道梗阻-再通的防治作用

齊慶安，祝建勇，王錦波

梗阻性黃疸（obstructive jaundice，OJ）是臨床上各種原因引起的肝外膽管阻塞后所發生的膽汁瘀積癥，由于膽汁瘀積，?？蓪е聫碗s而嚴重的全身性病理生理改變。傳統的圍手術期治療方法療效欠佳，而重組人生長激素（recombinant human growth hormone，rhGH）在OJ時對肝損害的防治作用的研究報道很少。本研究采用膽道梗阻-再通大鼠模型，觀察應用重組人生長激素后動物血生化和血清TNF-α的變化，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 6～8周齡Spragure-Dawley大鼠，雌雄不限，體重180～220 g，隨機將大鼠分為3組。A組：假手術組（sham operation），只游離出膽總管但不結扎，7 d后再次開腹分離粘連后關腹；B組：膽道梗阻（common bile duct ligation，CBDL）-再通（bile duct reconstruction，BDR）組，開腹游離出膽總管，3-0號絲線雙重結扎，術后第7天再次開腹，行內引流術，同時，從術后第1天開始，每日皮下注射等體積的0.9%NaCl；C組：膽道梗阻-再通-rhGH注射組，手術方式同B組，從術后第1天開始，給予rhGH（瑞士Serono大藥廠生產Saizen，4U/支）0.5U/kg皮下注射，1次/d，直至動物被處死。分別在A、B、C 組大鼠第一次手術后 1、3、7、10、14 d 5 個時相點（每個時相點保證有6只動物），于下腔靜脈穿刺取血4～5 ml，4℃，3 000×g 離心 15 min，取上清置于-70℃冰箱保存待測。采血后，經門靜脈灌注0.9%NaCl注射液沖去血液，取肝組織，在10%甲醛水溶液中固定12～24 h再修剪成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm組織塊；另在3%戊二醛水溶液中修剪成0.5mm×0.5mm×0.5 mm的組織塊，固定2～4 h，備電鏡檢查。

1.2 生化檢測 采用北京中山公司提供的谷丙轉氨酶檢測試劑盒（賴氏法）檢測ALT的變化，總膽紅素檢測試劑盒（重氮法）檢測TBIL的變化，采用上海長征醫學科技有限公司提供的總膽汁酸檢測試劑盒（循環酶法）檢測TBA的變化，采用解放軍總醫院科技開發中心放免所提供的腫瘤壞死因子α檢測試劑盒（放免法）檢測TNF-α的變化。

1.3 統計學處理 計數資料采用χ2檢驗。計量資料求出±s，應用SPSS 11.5軟件進行統計學分析，組間均數的比較采用雙因素方差分析。

2 結 果

2.1 SD大鼠術后一般情況 B組術后7 d存活率為88.0%（88/100），死亡的12只動物中因麻醉意外死亡1只，膽漏2只，全身衰竭9只；膽道再通術后7 d存活率為69.2%（36/52），死亡的16只中麻醉意外3只，全身衰竭4只，出血4只，術后膽漏繼發腹腔內感染5只。B組術后14 d大鼠累積死亡率為41.9%（13/31），與C組的累積死亡率14.3%（3/21）相比，具有統計學差異（P<0.05）。

2.2 血清ALT、TBIL及TBA水平變化 B、C組CBDL術后 ALT、TBIL、TBA 水平顯著升高（P<0.01），BDR術后上述指標逐步好轉，至術后14 d時接近但仍顯著高于A組水平（P<0.05）；給予rhGH的C組大鼠各項指標的改善明顯優于0.9%NaCl注射的B組，隨用藥天數的增加，效果更趨明顯，特別是在術后14 d ALT水平已回落至A組水平，并顯著低于B組（P<0.05）。

2.3 血清TNF-α的水平變化 B、C組CBDL術后TNF-α濃度上升，隨梗阻時間的延長，與A組逐漸出現非常顯著的差異（P<0.01）。BDR術后TNF-α逐漸下降，C組下降更為顯著（P<0.05），于術后7 d達到A組水平，且與B組具有統計學差異（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠術后不同時間血清TNF-α水平（ng/ml，±s）

表1 各組大鼠術后不同時間血清TNF-α水平（ng/ml，±s）

與 A 組比較，*P<0.05，**P<0.01；與 B 組比較，#P<0.05，##P<0.01

時相點 A組 B組 C組術后 1 d 0.95±0.19 1.23±0.38* 1.26±0.40*術后 3 d 0.89±0.15 1.46±0.48* 1.34±0.48*術后 7 d 0.94±0.17 4.14±0.70** 3.83±0.63**#術后 10 d 0.92±0.18 3.23±0.71** 1.67±0.21*##術后 14 d 0.96±0.19 1.38±0.29* 0.93±0.15#

2.4 膽道梗阻-再通術后肝臟病理形態學改變 A組大鼠呈正常肝小葉結構。B、C組大鼠CBDL術后肝小葉結構尚完整，肝細胞淤膽，中央靜脈周圍肝細胞內可見無折光性、棕褐色膽色素顆粒沉積，隨梗阻時間的延長，肝細胞內色素顆粒增大更加顯著，部分肝細胞濁腫變性、壞死，部分肝細胞脂肪變性。匯管區明顯炎性細胞浸潤，小膽管增生，膽栓形成（圖1）。膽道再通術后，匯管區仍有較多炎性細胞浸潤，肝細胞壞死少見，總體上解除梗阻后病理改變明顯減輕（圖2）。

透射電鏡觀察顯示，A組肝細胞形態正常。B、C組CBDL術后肝細胞胞質疏松，核圓縮，線粒體明顯腫脹，嵴斷裂、減少，基質透明性變，以致線粒體呈空泡狀，內質網擴張，毛細膽管管徑增加（圖3）。BDR術后肝細胞線粒體仍顯著腫脹，微絨毛數量增加，毛細膽管腔內可見散在微絨毛膜泡。C組肝細胞線粒體腫脹、毛細膽管擴張以及單位面積微絨毛數量減少均較B組減輕，至術后14d時，肝細胞及毛細膽管形態恢復較好，微絨毛數量明顯增加（圖4）。

圖1 CBDL術后7 d肝組織學改變（HE×400）匯管區見中性粒細胞浸潤，小膽管增生

圖2 BDR術后7 d肝組織學改變（HE×400）肝細胞排列紊亂，細胞質疏松，匯管區見中性粒細胞浸潤，小膽管增生，肝細胞壞死減少

圖3 B組膽道梗阻術后7 d超微結構改變（×10 000）肝細胞線粒體腫脹，基質密度減低呈空泡狀，嵴斷裂減少

圖4 C組膽道再通術后7 d超微結構改變（×7 000）肝細胞線粒體腫脹減輕，基質密度稍低

3 討 論

梗阻性黃疸是臨床上常見的疾病，患者術后容易發生急性胃黏膜病變、急性腎功能衰竭、免疫功能障礙乃至全身炎癥反應綜合征、凝血機制紊亂甚至彌散性血管內凝血等嚴重并發癥，病死率亦居高不下。生長激素是腦垂體前葉分泌的一種蛋白質，由191個氨基酸殘基組成的多肽，其主要作用是促進生長發育和影響代謝，既往主要用于兒童生長激素缺乏癥的治療，近年來隨著臨床研究的深入，發現生長激素具有促進肝細胞、胃腸黏膜上皮細胞、燒傷后殘存上皮細胞和軟骨細胞等多種細胞增殖的能力[1]。目前已經在腸瘺、慢性消耗性疾病及全胃腸外營養支持治療中得到廣泛應用，但在梗阻性黃疸中的研究尚缺乏[2～4]。

梗阻性黃疸常伴隨內毒素血癥，而TNF-α是其毒性的主要執行者。TNF-α可激活細胞因子的級聯反應，誘發白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-8、 血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、前列腺素和白三烯等的分泌，激發炎癥連鎖反應，導致所謂 “瀑布效應”[5～7]。 本文結果顯示，TNF-α在CBDL術后1d即有明顯上升（P<0.05），并隨梗阻時間的延長而逐步升高，與假手術組逐漸出現非常顯著的差異（P<0.01），至術后第7天時B組TNF-α的水平為A組的4.4倍；同時其對肝臟的負面影響也逐漸加重，表現為ALT、TBIL、TBA的顯著升高，至術后第7天時分別增高為A組的3.2、34.3、18.4倍。rhGH的應用降低了梗阻性黃疸時大鼠血清的TNF-α水平，減輕了肝組織損害，但直至術后第7天始顯著低于B組（P<0.05）。與此同時，rhGH部分改善了膽道再通術前大鼠的肝功能，血清 ALT、TBIL、TBA 水平均顯著低于 B 組（P<0.05），尤其后者更為顯著（P<0.01）。王向昱等[8]通過皮下注射rhGH治療重癥急性胰腺炎患者40例，亦發現rhGH能顯著降低急性壞死性胰腺炎胃腸黏膜組織炎性細胞因子、粘附分子與趨化因子的轉錄，從而發揮其胃腸道局部抗炎作用。筆者認為，此種“有益效應”主要與rhGH能保護腸黏膜屏障，減少細菌移位和內毒素吸收等有關。然而，rhGH并不能扭轉OJ時嚴重的病理生理改變，C組大鼠肝功能仍呈持續惡化趨勢，說明解除膽道梗阻是首要因素。梗阻解除后，C組大鼠肝功能指標以及TNF-α水平明顯低于同時相點的B組大鼠（P<0.05），至術后第14天時雖然TBIL與TBA仍顯著高于A組，但是ALT與TNF-α已恢復為正常水平，說明rhGH能促進OJ大鼠在BDR術后的恢復。

本實驗還發現，在52只行BDR手術的OJ大鼠中，有13只術前一般情況很差，黃疸嚴重，BDR術后7d內死亡8只，死亡率高達61.5%，占全部術后死亡的50.0%（8/16），且大多數是未應用rhGH的B組大鼠（6/8），說明在影響OJ大鼠手術危險性的因素中，TBIL以及TBA是重要的參考指標，而rhGH能顯著降低OJ大鼠在膽道再通術前的TBIL、TBA水平，并顯著降低術后第14天大鼠累積死亡率（P<0.05），說明rhGH能增強OJ大鼠的手術耐受性、提高安全性。Ram等[9]認為rhGH可能通過JAK/STAT5通路上調淤膽時鈉-牛磺膽酸鹽共轉運多肽（Na+-dependent taurocholate cotransporting polypeptide，Ntcp)的表達，從而起到“利膽”作用，但 rhGH對其它轉運子，特別是對肝細胞毛細膽管面轉運子的調節機制尚不清楚。

此外，筆者曾對重度OJ和淤膽性肝炎患者在用常規治療無法使黃疸減輕時，試用過rhGH治療，發現其具有較明顯的“利膽”作用。Sklar等[10]通過361例惡性腫瘤幸存患者接受rhGH治療后腫瘤復發情況的研究發現，腫瘤的復發率僅為0.83%，繼發性腫瘤的發生率為3.21%，rhGH治療與患者的病死率也沒有明顯聯系。因此，對于長期重度OJ，在解除梗阻的原則下，rhGH“利膽”、改善肝功能的作用可用于部分重癥患者的圍手術期處理。

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