肌苷氯化鈉注射液鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

張 萍，張 莉，于燕莉

肌苷氯化鈉注射液屬輔酶類藥,具有改善機(jī)體代謝的作用。臨床用于各種類型的肝臟疾患、心臟疾患、白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、中心視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮等。中華人民共和國國家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定其熱原檢查為家兔法[1]，用鱟試劑檢查肌苷氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素目前尚未見報(bào)道。為了提高其熱原檢查的快速性，有效性和靈敏度，本文參照中國藥典2005年版中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的有關(guān)規(guī)定及相關(guān)文獻(xiàn)，對該品種進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查法的可行性研究，報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，中國生物制品檢定所，70 EU/ml，批號 070121）。 鱟試劑（TAL，廈門鱟試劑廠，

批號 080120，標(biāo)示靈敏度 0.25 EU/ml，0.1 ml/支；湛江海洋生物制品廠，批號 080319，靈敏度 0.25 EU/ml，0.1 ml/支）。 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，湛江海洋生物制品廠，批號070914，2 ml/支，內(nèi)毒素含量＜0.03 EU/ml；肌苷氯化鈉注射液500 mg/100 ml（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司批號：20070407，20070612，20070918）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料、器皿 自動(dòng)旋渦混合器：天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠；DC-3型干式恒溫器：南京三愛斯技術(shù)有限開發(fā)公司；試管、吸管等所需器皿均經(jīng)250℃ 1h除去外源性內(nèi)毒素。

2 方法與結(jié)果

2.1 TAL靈敏度復(fù)核試驗(yàn) 按中國藥典2000年版附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[1]進(jìn)行操作，復(fù)核靈敏度 λc為 0.5～2.0 λ，表明試驗(yàn)用二個(gè)生產(chǎn)廠家的二批鱟試劑靈敏度標(biāo)示符合規(guī)定。結(jié)果見表1。

2.2 供試品的干擾初篩試驗(yàn)

2.2.1 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值（L）的確立[1]按公式L=K/M，內(nèi)毒素致熱閾K為按規(guī)定的給藥途徑，人用kg體重每h最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量，注射劑K值為5 EU/kg·h；M為人用每kg體重每h的最大劑量，人增體重按60 kg計(jì)算。根據(jù)肌苷氯化鈉注射液最大劑量為100 ml/60 kg·h，則細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值：L=K/M=5/（100/60）=3.0 EU/ml。

2.2.2 樣品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確立[1]按公式MVD=CL/λ 計(jì)算，則 MVD=1×3/0.25=12（倍）。

2.2.3 預(yù)干擾試驗(yàn)[2]用BET水分別將供試品溶液按照原液→1∶2→1∶4稀釋。同時(shí)，用此系列濃度的樣品溶液稀釋細(xì)胞內(nèi)毒素分別取不同稀釋度的供試品溶液將70 EU/mlCSE按 70 EU/ml→10 EU/ml→1.0 EU/ml，→0.5 EU/ml，→0.25 EU/ml→0.125 EU/ml→0.0625 EU/ml進(jìn)行稀釋，配制成含有不同稀釋濃度樣品的相應(yīng)內(nèi)毒素管。取內(nèi)毒素含量為0.5 EU/ml，0.0625 EU/ml各稀釋濃度的上述溶液各0.1 ml，分別加入已復(fù)溶的0.1 ml TAL安瓿中，進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，每一濃度平行做2管；另取0.1 ml內(nèi)毒素檢查用水加入已復(fù)溶的0.1 mlTAL安瓿中，作陰性對照，恒溫（37±1） ℃，保溫（60±2）min。 由表2的結(jié)果表明：原液2 λ全為陽性，1/4 λ全為陰性，陰性對照（NC）為陰性，陽性對照(PC)為陽性。說明注射液原液對鱟試劑反應(yīng)無干擾，不需稀釋即可作為正式試驗(yàn)的樣品[3]。

表1 鱟試劑的靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

表2 肌苷氯化鈉注射液預(yù)干預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 干擾試驗(yàn) 預(yù)試驗(yàn)表明，樣品原溶液對細(xì)菌內(nèi)毒不存在抑制或增敏作用，樣品不需稀釋即可用于試驗(yàn)，但仍需進(jìn)一步作干擾驗(yàn)證。將三批批號的肌苷氯化鈉原液將70 EU/ml的CSE 稀釋制得 0.5、0.25、0.125、0.0625 EU/ml系列內(nèi)毒素濃度溶液，各取0.1 ml加入0.1 ml BET水復(fù)溶的TAL安瓿中，每一濃度平行做4管。另取0.1 ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和樣品原液加入上述CSE安瓿中，各平行做2管，作為陰性對照，恒溫（37±1） ℃，保溫（60±2） min，觀察結(jié)果。

2.4 結(jié)果 依據(jù)中國藥典2005年版規(guī)定：用BET水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度幾何平均值Es和用供試品溶液制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度幾何平均值Et。

Xs、Xt分別為BET水和供試品溶液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值。

當(dāng) Es 值在 0.5～2.0 λ，Et在 0.5～2.0 Es，可以認(rèn)為供試品溶液在該濃度下對TAL不存在干擾。根據(jù)表3、4試驗(yàn)數(shù)據(jù)說明三批肌苷氯化鈉注射液在不需要稀釋的情況下，對細(xì)菌內(nèi)毒素檢測均無干擾，在進(jìn)行該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)可選用的鱟試劑靈敏度為0.25 EU/ml。計(jì)算結(jié)果見表5。

表3 肌苷氯化鈉注射液干預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表4 肌苷氯化鈉注射液干預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表5 干擾試驗(yàn)計(jì)算結(jié)果

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)批號的肌苷氯化鈉注射液分別用兩個(gè)不同廠家的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)。結(jié)果顯示樣品原液對鱟試劑不存在干擾作用。以上三批樣品，均經(jīng)熱原檢測（家兔法）合格，同時(shí)，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，樣品不需稀釋，鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml時(shí)測定結(jié)果為陰性，干擾試驗(yàn)結(jié)果符合要求。說明用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可替代熱原檢查法。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.附錄 P86,204.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2001.389.

[3]黃清泉,夏振民.藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì).中國藥學(xué)雜志,1997,32(2)：72.

[4]中華人民共和國國家藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn).WS-1061(X-796)-2002.