苦參堿對上皮性卵巢癌細胞株順鉑敏感性的影響及其機制研究

張繼榮

湖南省腫瘤醫院（410013）

惡性腫瘤作為一種威脅人類生命健康以及降低生活質量的重大疾病，發病率呈現明顯上升的趨勢。卵巢惡性腫瘤的發病率居女性生殖器官惡性腫瘤的第3位[1,2]。由于病變部位的組織結構復雜性以及早期診斷手段的不足，卵巢癌的診治一直都是婦科領域的重要研究課題。盡管腫瘤細胞減滅術以及聯合鉑類藥物為基礎化療的綜合治療一定程度上能夠緩解病痛，降低該類腫瘤患者的病死率。但是卵巢癌的復發率以及病死率仍然較高。其中，因為腫瘤細胞耐藥導致的化療失敗是一個及其重要的原因，也是目前卵巢癌治療面臨的難題之一。相關學者也在不斷的尋找增加卵巢癌患者對于化療藥物的敏感性的方法[3-5]?？鄥A是從中藥苦參的干燥根中提取的活性物質，近年來的研究結果表明苦參堿在抑制腫瘤細胞增殖和誘導分化、誘導凋亡、抗腫瘤細胞黏附與浸潤轉移等方面發揮了重要作用。近年來，調控細胞增殖與凋亡的轉錄調節因子NF-κB以及相應信號轉導通路在各種抗腫瘤的輔助治療中的作用引起了眾多學者的關注。目前的研究已經明確，NF-κB的活性增加與參與凋亡抑制蛋白家族成員的表達量呈現正相關。其中Livin以及Survivin兩種最新發現的凋亡抑制因子與NF-κB活性間的關系對于理解藥物降低上皮細胞癌發生率這一現象具有相當的理論探討價值[6-8]。介于以上背景，筆者提出通過苦參堿抑制處理上皮性卵巢癌細胞，通過下調NF-κB——Livin、Survivin信號通路，達到增加腫瘤細胞對于順鉑敏感性的理論設想。本文旨在探討苦參堿干預與上皮性卵巢癌細胞對順鉑敏感性的關系，以及觀察NF-κB活性、Livin、Survivin表達量與苦參堿藥物干預間的聯系。為上皮性卵巢癌的治療提供借鑒性的信息。

1 資料與方法

1.1 細胞培養條件及傳代

OVCAR細胞在含10%小牛血清及RPMI-1640培養液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中常規培養，每1～2d更換培養液1次。細胞傳代方法：待細胞生長至培養基底板面積70%～80%，棄培養液，加2～5mL PBS漂洗2次，棄去。加2～3mL胰酶消化3～5min；鏡下看到細胞收縮變圓，棄消化液，再加3～5mL含小牛血清培養液，用吸管按順序輕輕吹打成細胞懸液，按照1∶2～3比例進行傳代，7℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中常規培養至對數生長期用于實驗。

1.2 主要試劑

噻唑藍（MTT）（北京鼎國生物技術有限公司）；NF-κB轉錄因子檢測試劑盒（Cayman公司）；蛋白提取試劑盒（Active Motif公司）；鼠抗人NF-κB一抗（BD公司）；鼠抗人Livin一抗（Alexis公司）；鼠抗人Survivin一抗（Cell Signaling公司）；羊抗鼠二抗（Sigmal公司）。

1.3 MTT法測定細胞對藥物的敏感性

取對數生長期細胞，經胰酶消化后配置成單細胞懸液。實驗設藥物處理組（加入順鉑藥物）、細胞對照組（不加藥物，只加細胞懸液）及空白對照組（加入培養液）。細胞培養24h后，分別加入0、10、20、25、30、35、40、50和60μmol/L的藥物，繼續培養24h。實驗終止前4h，加入5mg/mL MTT溶液20μL，繼續培養4h，除去每孔中培養液，加入DMSO 150 μL/孔，振蕩數分鐘使形成晶體完全溶解，酶聯免疫檢測儀測定492nm處吸光度值A492，并計算該濃度下抑制率，并使用直線回歸法計算藥物的半數抑制濃度（IC50）。實驗重復3次。存活率＝試驗組A492/對照組A492×100%，抑制率＝1－存活率。

1.4 ELISA法測定NF-κB核DNA結合轉錄活性

應用Cayman公司轉錄因子檢測試劑盒測定NF-κB核DNA結合活性。細胞培養孔中加入結合緩沖液90μL以及等量的核蛋白提取液。4℃過夜后用ELISA專用洗液每孔200μL沖洗。加入100μL稀釋后NF-κB一抗，室溫孵育1h，沖洗5次。加入100μL二抗室溫孵育1h，沖洗5次。每孔加入100μL發光液，室溫避光孵育40min，加入100μL終止液，450nm處讀數。在陽性對照正常顯色的前提下，計算各組樣本吸光度的平均值，繪制標準曲線，對各組OD值進行比較。

1.5 Western blot法檢測Livin、Survivin蛋白表達

總蛋白提取嚴格按照提取試劑盒說明書操作進行。蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用濕轉膜法。采用5%脫脂牛奶封閉后，使用TBST洗膜，分別加入各種一抗，4℃過夜后，加入二抗室溫反應1h。洗脫后顯影。根據預期相對分子質量大小區域出現的特異性條帶判斷蛋白表達量的高低。應用Bio-Rad公司Quantity-one軟件分析。

1.6 統計分析

采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。計量資料采用均數±標準差表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，P＜0.05為有統計學意義差異。

2 結 果

2.1 苦參堿增加順鉑對上皮性卵巢癌細胞的增殖的抑制作用

上皮性卵巢癌細胞在苦參堿作用后，對順鉑的敏感性均有增加，表現為藥物對細胞的增殖抑制效應增加，并且這種抑制效應隨濃度的增大而增大。其中，順鉑對10、40、160μmol/L苦參堿處理的3組細胞的IC50分別為（29.75±5.27）、（25.61±4.27）和（17.29±3.35）μmol/L，順鉑對對照組細胞的IC50為（31.65±2.23）μmol/L。具體結果見圖1。

圖1 不同濃度順鉑對各組細胞的抑制強度

2.2 苦參堿處理后各組細胞中NF-κB核轉錄活性的變化

圖2 Livin在上皮性卵巢癌細胞中表達的灰度分析

NF-κB核DNA結合活性檢測結果顯示，苦參堿處理各組細胞核內NF-κB蛋白表達較對照組呈現顯著降低，其中苦參堿（10、40、160μmol/L）處理的3組細胞的NF-κB蛋白表達分別為（0.507±0.027）、（0.375±0.019）和（0.311±0.017），對照組NF-κB蛋白表達為（0.705±0.032）。表明苦參堿處理可以使NF-κB從胞質進入細胞核內的轉錄活性降低。

2.3 苦參堿處理后各組細胞中Livin、Survivin蛋白表達的變化

Western blot檢測結果顯示，苦參堿作用于卵巢癌細胞后Livin、Survivin的表達呈濃度依賴性下調趨勢，與對照組比較，差異有統計學意義。具體結果見圖2。

3 討 論

卵巢惡性腫瘤的病死率居目前婦科生殖道惡性腫瘤病死率的首位，其原因除對其發生、發展過程尚缺乏了解外以及難以早期診斷外，治療過程中及易產生的藥物敏感性降低、腫瘤細胞對藥物耐受現象也是目前臨床一個棘手的問題。上皮性癌是最為常見的原發性卵巢癌，主要治療手段是腫瘤細胞減滅術輔以鉑類為主的化療。鉑類藥物作為卵巢上皮細胞腫瘤的一線化療藥物已經應用40余年，耐藥問題也日益突出，致使患者尤其是晚期腫瘤患者的生存率以及生活質量受到嚴重的影響。怎樣有效的提高腫瘤細胞對藥物的敏感性成為眾多學者關注的問題。最近的研究發現，化療后NF-κB的活化，可以上調凋亡抑制蛋白，增前凋亡抵抗，從而導致腫瘤細胞對于化療藥物的拮抗作用。這一信號轉導通路的改變可能是腫瘤細胞化療后藥物敏感性下降的途徑之一。苦參堿作為苦參中的重要活性物質，研究發現該成分可以阻止人白血病細胞的增殖周期，該藥物在誘導細胞凋亡的同時可以導致一些重要的細胞因子發生基因、蛋白水平的改變。該藥物的使用是否可以增加腫瘤細胞對藥物的敏感性以及其中潛在的機制是筆者本次研究探索的目標。

本次研究首先觀察苦參堿處理的細胞是否對順鉑的敏感性有增加的現象發生。結果顯示，順鉑對10、40、160μmol/L苦參堿處理的3組細胞的IC50分別為（29.75±5.27）、（25.61±4.27）和（17.29±3.35）μmol/L，順鉑對對照組細胞的IC50為（31.65±2.23）μmol/L。提示苦參堿能夠有效的增加腫瘤細胞對順鉑藥物的敏感性。并且這種增敏現象有著劑量依賴性。在此基礎上，我們發現NF-κB核DNA結合活性檢測結果顯示，苦參堿處理各組細胞核內NF-κB蛋白表達較對照組呈現顯著降低。該結果提示，苦參堿的作用可能是與NF-κB介導的凋亡抑制現象有關。

同時，本次研究重點關注NF-κB介導凋亡抑制信號通路中兩個重要的蛋白Livin、Survivin的表達情況。結果顯示上述兩種凋亡抑制蛋白的表達量在苦參堿處理后均呈現明顯的下調現象。因此，筆者認為苦參堿增加上皮性卵巢癌細胞的敏感性現象可那與其抑制NF-κB活性，阻斷凋亡抑制蛋白Livin、Survivin蛋白的表達，誘導細胞的凋亡現象有關。

本此研究將NF-κB及其信號通路為觀察對象。NF-κB作為一種與腫瘤細胞凋亡關系密切的功能蛋白，研究其介導的信號轉導通路與順鉑藥物敏感性的關系，對于我們擴展腫瘤治療的思路，預測細胞對藥物的敏感性有著積極的借鑒意義。

[1] 趙霞,鐘茜.卵巢癌早期篩查的爭議與展望[J].西部醫學,2009,21(1):1-2.

[2] Ozols RF,Bookman MA,Connolly DC,et al. Focus on epithelial ovarian cancer [J]. Cancer Cell,2004,5(1): 19-24.

[3] Rabik CA,Dolan ME. Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated with platinating agents [J]. Cancer Treat Rev,2007,33 (1): 9-23.

[4] Chen YJ,Yan Z,Shen C,et al. A systems biology approach to the study of cisplatin drug resistance in ovarian cancers [J]. J Bioinform Comput Biol,2007,5 (2a): 383-405.

[5] Brown DP,Chin-Sinex H,Nie B,et al. Targeting superoxide dismutase 1 to overcome cisplatin resistance in human ovarian cancer [J].Cancer Chemother Pharmacol,2009,63 (4): 723-730.

[6] Dolcet X,Liobet D,Pallares J,et al. NF-κB in development and progression of human cancer [J]. Virchows Arch,2005,446(5):475-482.

[7] Ulivi V,Giannoni P,Gentili C,et al. p38/NF-κB-dependent expression of CO2 during differentiation and inflammatory response of chondrocytes [J]. J Cell Biochem,2008,104 (4):1393-1406.

[8] Peralta EA,Murphy LL,Minnis J,et al. American Ginseng inhibits induced CO2 and NF-κB activation in breast cancer cells [J].J Surg Res,2009,157 (2): 261-267.