離子色譜法在糖和糖醇分析檢測(cè)中的應(yīng)用研究

劉玉峰， 唐華澄， 李 東

(北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所 分析室， 北京 100069)

國(guó)標(biāo)方法GB/T 22221—2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的測(cè)定高效液相色譜法》[1]和GB/T 22222—2008《食品中木糖醇、山梨醇和麥芽糖醇的測(cè)定高效液相色譜法》[2]的實(shí)施，為食品中糖和糖醇的定量檢測(cè)提供了一個(gè)方便、快捷、準(zhǔn)確的方法，然而，使用氨基色譜柱，高效液相色譜儀測(cè)定糖和糖醇時(shí)，會(huì)出現(xiàn)糖和糖醇分離不太好的情況，當(dāng)食品中木糖醇和葡萄糖、麥芽糖和麥芽糖醇同時(shí)存在時(shí)，如果選用的氨基色譜柱不合適，糖和糖醇就可能分不開(kāi)[3]，實(shí)驗(yàn)人員就會(huì)選擇不同品牌的色譜柱去完成實(shí)驗(yàn)[4-5]，產(chǎn)生了較多的工作量，而采用離子色譜法，就不會(huì)給操作者帶來(lái)困擾，同時(shí)提高了檢出限. 本文參考AOAC Official Method 995.13[6]和AOAC Official Method 2000.17[7]，同時(shí)完成了果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖醇、山梨醇、甘露醇和麥芽糖醇的分離.

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

ICS-3000離子色譜儀，脈沖安培檢測(cè)器，Au電極.

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試劑

單雙糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：葡萄糖(Fluka)、果糖(Fluka)、乳糖(Fluka)、蔗糖(Fluka)、麥芽糖(Fluka)；糖醇標(biāo)準(zhǔn)：木糖醇(Sigma)、山梨醇(Sigma)、甘露醇(Sigma)、麥芽糖醇(Sigma)；試劑：50%NaOH(Fluka)，磺基水楊酸.

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱(chēng)取經(jīng)過(guò)干燥的木糖醇0.025 g、山梨醇0.025 g、甘露醇0.025 g、麥芽糖醇0.025 g、葡萄糖0.025 g、果糖0.075 g、蔗糖0.125 g、乳糖0.100 g、麥芽糖0.125 g(精確至0.01 mg)置25 mL容量瓶，加水溶解定容，每mL溶液中有1.00 mg木糖醇、1.00 mg山梨醇、1.00 mg甘露醇、1.00 mg麥芽糖醇、1.00 mg葡萄糖、3.00 mg果糖、5.00 mg蔗糖、4.00 mg乳糖、5.00 mg麥芽糖.

1.2 分析方法

準(zhǔn)確稱(chēng)量1 g(精確至0.1 mg)樣品(稱(chēng)樣量根據(jù)糖和糖醇的含量適當(dāng)增減)，加入約50 mL80 ℃蒸餾水，80 ℃水浴振搖20 min，冷卻至室溫，加入20 mL 3%磺基水楊酸溶液，用蒸餾水定容至100 mL，靜置15 min，過(guò)濾，濾液依次過(guò)0.45 μm水相濾膜、RP柱、0.45 μm水相濾膜(根據(jù)工作曲線的線性范圍確定是否將濾液進(jìn)行稀釋).

色譜工作條件：

1) 梯度洗脫程序

色譜柱：CarbopacTMPA1，4 mm×250 mm(帶CarboPacTMPA1 4 mm×50 mm保護(hù)柱).

柱溫：30 ℃；

淋洗液：0～5 min,20 mmol/L NaOH；5～12 min,20 mmol/L～200 mmol/L NaOH；12～30 min,200 mmol/L NaOH；30.1～45 min,20 mmol/L NaOH；

流速：1 mL/min;

進(jìn)樣量：10 μL.

2) 檢測(cè)器波形

0.00 s，0.10 V；0.20 s，0.10 V，開(kāi)始積分；0.40 s，0.10 V，積分結(jié)束；0.41 s，-2.00 V；0.42 s，-2.00 V；0.43 s，0.60 V；0.44 s，-0.10 V；0.50 s，-0.10 V.

2 結(jié)果與討論

2.1 梯度洗脫程序的確定

本文使用CarbopacTMPA1色譜柱，選擇等度洗脫，淋洗液濃度為200 mmol/L NaOH時(shí)，麥芽糖醇和果糖分離不好，其他8種物質(zhì)都可以實(shí)現(xiàn)等度洗脫. 為了實(shí)現(xiàn)麥芽糖醇和果糖的分離，不斷優(yōu)化淋洗條件，發(fā)現(xiàn)低濃度淋洗對(duì)弱保留物質(zhì)保留時(shí)間的影響不是很大，但是明顯影響了其他物質(zhì)的保留時(shí)間，因此如果使用低濃度等度淋洗，強(qiáng)保留物質(zhì)出峰時(shí)間太長(zhǎng)，不適用于日常檢測(cè)，最后確定了梯度洗脫. 在梯度洗脫的過(guò)程中，蔗糖和乳糖的出峰順序也發(fā)生了改變. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分離見(jiàn)圖1.

1.木糖醇 2.山梨醇 3.甘露醇 4.麥芽糖醇 5.葡萄糖 6.果糖 7.蔗糖 8.乳糖 9.麥芽糖圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standards

譜圖表明，采用該方法對(duì)糖醇和單雙糖可以進(jìn)行有效的分離.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配制一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液依次進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，這九種糖和糖醇都有很好的線性回歸和較寬的線性范圍，見(jiàn)表1.

2.3 方法檢出限

采用脈沖安培檢測(cè)器，進(jìn)樣10 μL，根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)可分別計(jì)算出9種糖和糖醇的檢出限分別為質(zhì)量濃度1，1，1，1，1，1，1，2和2 μg/g.

2.4 樣品測(cè)定

本文對(duì)蘋(píng)果、芹菜、木糖醇酸牛奶、飲料樣品等進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)單，檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于液相色譜法，可行性好.

表1 9種糖和糖醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 沉淀劑的選擇

查閱資料可知，一般蛋白沉淀劑選用鹽、酸、乙醇、乙腈，本文從樣品類(lèi)型、淋洗液、色譜柱等方面考察了沉淀劑的選擇. 由于離子色譜使用的色譜柱是離子交換柱，所以在樣品處理過(guò)程中要避免離子的帶入，所以選用鹽做沉淀劑是不可行的. 另外，該方法使用了CarboPacTMPA1 色譜柱，該色譜柱有機(jī)溶劑的兼容性最大，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%，因此，乙腈也不是合適的沉淀劑. 乙醇的沉淀能力不太強(qiáng)，因此本文選用酸做沉淀劑，但是強(qiáng)酸會(huì)分解部分雙糖和低聚糖，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，本文確定了質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為3%的磺基水楊酸作為沉淀劑.

3 精密度和準(zhǔn)確度

3.1 精密度

準(zhǔn)確稱(chēng)取蘋(píng)果、山楂果肉飲料、酸奶各6份，經(jīng)相同的前處理后，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2.

3.2 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 0 g山楂果肉飲料3份，分別加入山梨醇5 mg、甘露醇0.5 mg、葡萄糖20 mg、果糖50 mg、蔗糖20 mg，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)定回收率. 得到結(jié)果，平均回收率在96%～101%之間.

表2 精密度結(jié)果

注：RSD為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.

4 結(jié) 論

本方法僅適用于添加了糖和糖醇的食品以及植物水果中天然存在的糖和糖醇的檢出，目前市場(chǎng)上一些食品不一定添加了本文所提及的所有糖和糖醇，如果樣品中沒(méi)有添加麥芽糖醇，可以采用200 mmol/L NaOH等度洗脫，否則必須采用梯度洗脫. 在實(shí)際樣品測(cè)定過(guò)程中，本方法表現(xiàn)了較好的重現(xiàn)性和較高的準(zhǔn)確度，以及較高的檢出限.