17β-雌二醇對血管性癡呆大鼠海馬CA1區神經突觸可塑性的影響

孫玉華 賀維亞

河南大學淮河醫院神經內科 開封 475000

近年來研究證實,雌激素對中樞神經系統損傷后有保護作用,并能改善記憶和認知功能[1],但其作用機制尚不十分清楚。為此,我們通過免疫組化、RT-PCR方法,觀察雌二醇對VD大鼠海馬CA1區MAP-2蛋白含量和MAP-2mRNA,SYN蛋白含量和SYNmRNA表達的變化,探討雌二醇在調節VD大鼠神經突觸可塑性中的作用。

1 材料與方法

1.1動物與分組動物均選用＞16月齡的健康Wister大鼠60只,體質量450～550 g,由河南省實驗動物中心提供。以Y型電迷宮法篩選記憶良好的大鼠60只[2],隨機分成假手術組、模型組、治療組。治療組于術后第2天起予以腹腔注射17β-雌二醇(花生油溶解500 μ g/mL),假手術組和模型組給予等量消毒花生油。連續給藥30次,隔天1次,共60 d。

1.2試劑17β-雌二醇(美國Sigma公司);SP免疫組化染色試劑盒、兔抗M AP-2多克隆抗體、兔抗SYN多克隆抗體(均購自北京中山生物技術有限公司)。

1.3動物模型的建立根據Olsson方法[3],術前12 h禁食、6 h禁水。10%水合氯醛(0.30 mL/100 g)腹腔注射麻醉,沿腹側頸正中切開,氣管旁分離出雙側頸總動脈,以“0”號線雙重結扎頸總動脈。假手術組動物行頸前切開,分離但不結扎頸總動脈。

1.4觀察指標

1.4.1 MAP-2和SYN免疫組織化學染色過程:石蠟切片常規制備過程。

1.4.2 半定量RT-PCR測定MAP-2和SYN蛋白mRNA:①PCR引物序列及擴增片斷長度依照己知的合成:M AP-2,SYNcDNA序列,由上海捷倍思基因技術有限公司設計。βactin上游5'CCTCTATGCCAACACAGTGC3'下游5'GTACT CCTGCT TGCTGATCC3'擴增長度長度為211bp,MAP-2上游 5'AGCACACGAAGCAGGGTACA3'下游5'GCAATAGAATCAAGGCAAGAC 3'擴增長度長度為259bpSYN上游5'C ACGGACCCAGAGA ACATTA 3'下游5'GGACT TCACTGACCAGAT TAC 3'擴增長度長度為447bp。②組織總RNA的抽提嚴格按試劑盒操作說明書進行。③RNA電泳鑒定總RNA完整性,測定總 RNA純度、濃度,RT-PCR反應。

1.5統計學處理數據以均數士標準差(s)表示,然后運用SPSS 11.5統計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),多個樣本均數的兩兩比較用q檢驗法。取α=0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 MAP-2和SYN免疫組織化學染色結果Sham組MAP-2及SYN陽性產物呈黃褐色,主要位于神經元胞體中,呈纖維條索狀,連續;VD組在術后 60 d時,海馬CA1區陽性產物脫失加重,連續性破壞,部分幾乎全部脫失,僅見粗大、深染顆粒。E組海馬CA1區陽性產物脫失明顯減輕。術后各組海馬神經元MAP-2及SYN表達水平的比較顯示,VD組和E組M AP-2陽性產物光透過值(OD)均高于Sham組(P＜0.05),VD組的MAP-2陽性產物光透過值(OD)均顯著高于E組(P＜0.05),見表1。

表1 海馬CA1區MAP-2和SYN的OD值比較

表2 海馬 CA1區MAP-2 M RNA和SYN mRNA相對表達率

2.2 MAP-2 mRNA和SYN mRNA半定量RT-PCR結果與Sham組比較,VD組和E組海馬神經元MAP-2mRNA及SYNmRNA相對表達量顯著減少P＜0.05):且VD組少于E組(P＜0.05)。見表2。

3 討論

MAP-2是神經元的一種骨架蛋白,主要存在于神經元的樹突中。Li等[4]發現,局灶性腦缺血再灌注6 h,在缺血中心區即有MAP-2的蛋白表達的增高,本研究發現VD組和E組MAP-2的mRNA和蛋白的表達在術后均降低,提示2-VO術后均有神經元的進一步損害。術后60 d雌二醇組MAP-2mRNA和蛋白的表達均高于VD組(P＜0.05),提示雌二醇治療可以增加VD大鼠海馬MAP-2的表達。說明雌二醇可能在2-VO術后促進海馬神經元發出新突起。

而突觸素(SYN)是突觸囊泡的一種鈣結合蛋白,參于神經遞質的釋放,突觸的形成是突觸功能的生化物質基礎。因此,在許多神經結構重建研究中,SYN被用作神經末梢的定量指標[5-6]。本研究發現:術后60 d雌二醇組SYNmRNA和蛋白的表達均高于 VDO Perrella和Bhavnani[7]發現 17β-雌二醇可以減少神經細胞的死亡。在新生嚙齒動物海馬區大腦皮質或下丘腦獲得的分散細胞中加入雌激素,能導致神經樹突生長,突觸增多[8]。本研究提示,雌二醇治療可以增加VD大鼠海馬SYN的表達,減輕突觸受損,促進突觸重建,這些研究為雌激素應用于臨床治療VD提供理論依據。

[1]王建平,張芳芳,劉春嶺,等.不同劑量17β-雌二醇對血管性癡呆大鼠的神經保護作用[J].中國腦血管病雜志,2008,5(2):64-69.

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