bFGF對腦缺血再灌注大鼠ICAM-1表達及腦組織含水量的影響

聞公靈 婁季宇 白宏英

1)河南南陽市中心醫院神經內科 南陽 473009 2)鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014

研究發現腦缺血再灌注損傷時的炎癥反應促進了腦梗死的繼發性腦損害。細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule1,ICAM-1)是最重要的白細胞-內皮細胞間黏附分子之一,其在腦缺血再灌注損傷中的作用成為急性缺血性腦卒中研究的熱點。本實驗將通過觀察bFGF對缺血再灌注腦組織中性粒細胞浸潤和對ICAM-1表達的檢測,探討bFGF對腦缺血再灌注損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組及給藥選擇體質量為270～320 g的健康SD大鼠48只,雌雄各半(由河南省實驗動物中心提供),隨機分成假手術組、缺血再灌注組、bFGF組,每組16只。bFGF為北京雙鷺藥業股份有限公司研制,用注射用水稀釋,bFGF組腹腔注射10μ g/kg,其余組腹腔注射等量生理鹽水,缺血后即刻給藥。

1.2動物模型制作用體積分數為10%的水合氯醛300 mg/kg麻醉,采用 Longa等[1]的線栓法建立大腦中動脈(MCA)閉塞模型。缺血再灌注組及bFGF組均給予缺血1 h再灌注24 h,屆時灌注取腦、固定、脫水、透明、包埋。假手術組除不插線外,余同上。

1.3大鼠腦含水量的測定造模后,快速斷頭,開顱取腦,取右側前腦1/4部分稱重(濕腦重),然后在 110°C烤箱中烤至恒重,分析天平稱重(干腦重),計算腦含水量%=(濕腦重-干腦重)/濕腦重×100%。

1.4腦缺血后腦毛細血管通透性測定每組取8只大鼠,假手術組于尾靜注伊文思藍50 mg/kg,不阻斷大腦中動脈,其余兩組則在阻斷大腦中動脈前5 min由尾靜注伊文思藍50 mg/kg。缺血1 h再灌注24 h后,斷頭取腦,稱重,將腦浸泡于5 mL甲酰胺中,在45°C恒溫箱中溫育72 h。取溫育液,用722型分光光度計在620 nm處測定吸收度,根據標準曲線計算出腦內伊文思藍的含量(ug/g濕腦重)。

1.5腦缺血大鼠腦組織形態觀察每組取8只大鼠,屆時灌注取腦、固定、脫水、透明、包埋。HE染色,光鏡檢查。觀察白細胞浸潤。

1.6免疫組織化學染色檢測ICAM-1 采用SABC法,石蠟切片常規脫蠟至水,過氧化氫封閉,抗原熱修復 20 min,血清封閉,滴加1∶100兔抗ICAM-1抗體(購自博士德生物公司),4℃過夜,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate bufferad satine,PBS)洗,滴加生物素化的羊抗兔IgG 37℃孵育1 h,PBS洗,滴加ABC復合物37℃孵育1 h,PBS液洗,DAB顯色,鏡下控制反應時間,雙蒸水終止反應,脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。10×40倍光鏡下,在缺血區計數5個視野,計數陽性微血管數(血管內皮細胞胞漿、胞膜被染成棕黃色顆粒狀),取其均值,以陽性微血管數/高倍視野表示。

1.7統計學處理采用SPSS12.0統計分析軟件進行處理,數據以均數±標準差(s)表示,組間比較采用 t檢驗。取α=0.05作為檢驗水準,P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1缺血再灌注腦組織含水量的變化及bFGF對其的影響實驗結果表明,大鼠缺血1 h再灌注 24 h后,腦組織出現明顯水腫,表現為腦缺血再灌注組腦含水量與假手術組比較有明顯增加,有顯著性差異;而bFGF組腦含水量較缺血再灌注組明顯減少,有顯著性差異。表明bFGF能夠對抗因腦缺血再灌注造成的腦組織水腫現象。結果見表1。

表1 缺血再灌注腦組織含水量的變化及bFGF對其影響 (s)

表1 缺血再灌注腦組織含水量的變化及bFGF對其影響 (s)

與缺血再灌注組比較,△P＜0.05

組 別 n 含水量(%)假手術組 8 75.38±10.71缺血再灌注組 8 84.92±13.58 bFGF組 8 77.81±9.43△

2.2缺血再灌注腦血管通透性的變化及bFGF對其的影響結果表明,與假手術組比較,腦缺血再灌注組大鼠腦血管通透性增加,表現為單位腦組織伊文思藍含量顯著升高bFGF組腦組織中伊文思藍含量明顯減少,使單位腦組織伊文斯藍含量恢復至正?；蚪咏Ｋ?與缺血再灌注組比較有顯著性差異。結果見表2。

表2 缺血再灌注腦血管通透性的變化及bFGF對其影響 (s)

表2 缺血再灌注腦血管通透性的變化及bFGF對其影響 (s)

△與缺血再灌注組比較,P＜0.05

組 別 n 伊文斯藍含量(ug·g-1)假手術組 8 4.01±0.83缺血再灌注組 8 7.51±1.69 bFGF組 8 5.25±2.63△

2.3缺血再灌注腦組織形態學變化及bFGF對其的影響鏡下所見,假手術組大鼠腦組織神經細胞形態結構正常;毛細血管腔較窄,神經細胞、毛細血管周圍都產生空隙。缺血再灌注組腦組織出現明顯的梗死灶,光鏡下可見大量神經元變性壞死,間質水腫明顯,神經細胞及毛細血管周圍空隙增寬。bFGF組多數神經元結構較完整,形態相對正常,間質水腫輕,神經細胞周圍無明顯的空隙,毛細血管周圍的空隙明顯減小。

2.4缺血再灌注腦組織ICAM-1陽性表達血管的變化及bFGF對其的影響假手術組未觀察到ICAM-1陽性微血管,缺血再灌注組可見較多ICAM-1陽性微血管,在腦組織切片中ICAM-1免疫陽性染色可見于微血管的內皮細胞上,明顯的免疫陽性染色出現在缺血再灌注側半球,并主要局限于缺血區。bFGF組ICAM-1陽性微血管數較缺血再灌注組明顯減少(P＜0.05),見表 3。

表3 缺血再灌注腦組織ICAM-1陽性表達血管變化及bFGF對其影響 (s)

表3 缺血再灌注腦組織ICAM-1陽性表達血管變化及bFGF對其影響 (s)

與缺血再灌注組比較,△P＜0.05

組 別 n ICAM-1假手術組 8 ——缺血再灌注組 8 24.41±5.33 bFGF組 8 19.53±5.07△

3 討論

腦缺血再灌注時,缺血灶內聚集較多細胞因子及黏附分子,造成白細胞大量聚集,阻塞微血管,并釋放大量的炎性介質,腦組織水腫明顯。腦組織含水量能反映腦水腫的程度。檢測腦組織中伊文氏藍含量的高低可反映血腦屏障通透性變化的程度[2]。本實驗采用bFGF干預大鼠缺血1 h再灌注24 h,測量各組腦組織含水量、毛細血管通透性變化情況,結果顯示缺血再灌注組的腦組織含水量、腦血管通透性明顯增加。

腦缺血再灌注后腦水腫加重的原因是多方面的,其中白細胞與血管內皮細胞的牢固黏附及其后所產生一系列的病理反應[3],是腦缺血再灌注后血腦屏障破壞和腦水腫發生的重要原因之一。ICAM-1在白細胞與血管內皮細胞的牢固黏附過程中起重要作用。本實驗觀察到,在損傷區皮質,假手術組未見ICAM-1陽性微血管,缺血再灌注組可見較多的ICAM-1陽性微血管,在病灶區及半暗帶區均可見到。應用HE染色觀察缺血區腦組織病理變化情況,結果顯示假手術組大鼠腦組織神經細胞形態結構正常,毛細血管腔較窄,神經細胞、毛細血管周圍都產生空隙。大鼠MCAO 1 h再灌注24 h后,腦組織出現明顯的梗死灶,光鏡下可見大量神經元變性壞死,呈現胞體皺縮、變形、核固縮,胞漿濃縮呈深伊紅染色,神經細胞及毛細血管周圍空隙增寬,神經膠質細胞明顯腫脹,間質疏松、水腫。

bFGF是一種重要的神經營養因子,廣泛分布于成熟和未成熟的中樞神經系統內,通過與其相應受體結合發揮神經保護作用。當腦組織受到各種損傷時,外源性bFGF能通過受損的血腦屏障發揮其神經保護作用[4]。本實驗顯示缺血即刻給予bFGF,腦組織含水量明顯減少,毛細血管通透性下降。bFGF組多數神經元結構較完整,形態相對正常,間質水腫輕,神經細胞周圍無明顯的空隙,毛細血管周圍的空隙明顯減小。免疫組化法檢測ICAM-1顯示缺血區雖仍有較多ICAM-1陽性微血管,但較缺血再灌注組相比明顯下降,表明bFGF可抑制缺血再灌注后腦組織ICAM-1的表達,降低血管通透性,減輕缺血區腦組織水腫。其作用機制目前尚不清楚,有待進一步研究。

[1]Longa EZ,Weinsein P R,Canson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion withcraniectony in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2]史保中.腦出血的評價指標及其研究進展[J].國外醫學·神經病學神經外科學分冊,2002,29(3):207-209.

[3]姜亞軍,何家聲,丁德云.腦缺血再灌注期間白細胞黏附機制的研究進展[J].國外醫學腦血管疾病分冊,1996,4(5):261-263.

[4]Rothlein R,M ainolfi EA,Czajkowski M.A form of circulating ICAM-1 in human serum[J].J Immunol,1991,147(11):3 788-3 793.