血清冷球蛋白定量檢測(cè)在丙肝肝硬化診斷中的應(yīng)用研究△

天津市河西醫(yī)院(天津 300202)徐 心 王 沂 顧春剛 史 勇 劉淑學(xué)

現(xiàn)已明確丙型肝炎病毒(HCV)感染除引起肝臟病變外,還可引起多種肝臟外組織損害[1]。混合型冷球蛋白血癥(Mixed cryoglobulinemia,MC)是最為常見的 HCV感染肝外表現(xiàn)之一[2]。目前,伴發(fā)冷球蛋白血癥的 HCV感染導(dǎo)致肝纖維化的分子學(xué)機(jī)制正成為國(guó)外研究的熱點(diǎn)[3]。目前國(guó)內(nèi)尚未見有關(guān)CG在丙肝肝硬化診斷中的研究報(bào)道,本研究旨在探討血清 CG在HCV感染合并肝纖維化的診斷價(jià)值,現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

1 一般資料 病例來(lái)源于天津市河西醫(yī)院及天津市第三中心醫(yī)院住院及門診丙型肝炎與丙肝肝硬化患者 68例,其中男性 36例,女性32例,年齡15～ 78歲,其中丙肝肝硬化患者23例。所選病例均符合2000年全國(guó)《病毒性肝炎防治方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]及“肝纖維化診斷及療效評(píng)估共識(shí)”[5]的肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組 50例,為我院健康查體者,男女各 25例,均在清晨空腹采血。

2 檢測(cè)儀器及試劑

2.1 儀器:V ITALAB-MICRO半自動(dòng)生化分析儀(荷蘭VIT AL公司);SIGMA 2-MK低溫離心機(jī)(美國(guó) SIGM A公司);PH-3B型數(shù)字式酸度計(jì)(江蘇電分析儀器廠 B-42);分析天平(萬(wàn)分之一,上海長(zhǎng)江科學(xué)儀器廠 TG-328A);二六二廠XH-6020G免疫計(jì)數(shù)器;美國(guó) PE公司 GA-5700熒光檢測(cè)儀。

2.2 試劑:冷球蛋白(CG)定量檢測(cè)試劑自配[6];透明質(zhì)酸 (HA)、層粘蛋白 (LN)、Ⅲ 型前膠原 (PCⅢ )、Ⅳ型前膠原(PCⅣ)采用上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)中心放射免疫試劑盒;HCV-RNA擴(kuò)增引物選自 HCV基因組保守區(qū) 5′端 NC區(qū) nt序列。引物(primer,p)序列如下:pl 5′-AACTACTGTCTTCACG-CAGA-3′,p2 5′-CGCAGCACCCTACAGGCAG-3′,由上海 生物 工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

3 方 法

3.1 CG定量法:在半自動(dòng)生化分析儀上的參數(shù)為波長(zhǎng)598nm,溫度37℃,比色杯1.0cm。血標(biāo)本在室溫高于20℃時(shí)采取。預(yù)溫注射器及試管,分離血清1mL于Eppendorf管中,置 4℃冰箱中,7d后,在低溫離心機(jī)中2957×g離心 20min,將沉淀物用 0℃蒸餾水洗滌 2次后,在沉淀物中加入2mL鄰苯三酚紅試劑,37℃ 5min,以試劑空白調(diào)零點(diǎn),598nm處比色。計(jì)算方法:CGmg/L=U/S× 70mg/L。

3.2 透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ 型前膠原 (PCⅢ )、Ⅳ型前膠原(PCⅣ )層粘蛋白(LN)依據(jù)說(shuō)明書在XH-6020放免儀上檢測(cè)。

3.3 HCV-RNA檢測(cè):應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)。

3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用 SPSS 11.5軟件,采用t檢驗(yàn),相關(guān)分析采用 Pearson相關(guān)。

結(jié) 果

1 用 RT-PCR法檢測(cè) 68例 HCV陽(yáng)性患者,其中23例丙肝肝硬化。對(duì)照組50例,分別檢測(cè)其血清CG含量。結(jié)果見表1。CG＞293.2mg/L組與其他兩組比較,在單純 HCV感染患者中有顯著性意義(P＜0.01);在丙肝肝硬化患者中有顯著性意義(P＜0.01)。提示 CG升高與 HCV感染及丙肝肝硬化的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。

2 檢測(cè)不同年齡 CG在 HCV感染及丙肝肝硬化中的含量,見表 2。

通過(guò)對(duì) HCV感染及丙肝肝硬化患者不同年齡 CG含量檢測(cè)的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),在單純 HCV感染的不同年齡組之間,CG定量檢測(cè)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);在丙肝肝硬化患者的不同年齡組之間,CG定量檢測(cè)結(jié)果有顯著性意義(P＜0.01)。表明CG含量與肝纖維化的年齡呈正相關(guān)。

3 檢測(cè)患者攜帶 HCV病毒不同持續(xù)時(shí)間的 CG在 HCV感染及丙肝肝硬化中的含量,見表3。

通過(guò)對(duì)患者攜帶 HCV病毒不同持續(xù)時(shí)間CG含量檢測(cè)的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),在單純 HCV感染組及丙肝肝硬化組中,攜帶HCV病毒不同的持續(xù)時(shí)間組之間,CG定量檢測(cè)結(jié)果有顯著性意義(P＜0.01)。表明CG含量在兩組患者中均與攜帶 HCV病毒持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)。

4 檢測(cè)不同性別 CG含量與肝硬化發(fā)生的關(guān)系,見表 4。

表1 血清 CG定量在患者組與對(duì)照組的結(jié)果(%)

表2 血清 CG在不同年齡患者組的檢測(cè)結(jié)果

表3 血清 CG在不同病程患者組的檢測(cè)結(jié)果

表4 不同性別患者組血清 CG的檢測(cè)結(jié)果與肝硬化關(guān)系

在 CG＞ 293.2mg/L組中,男女發(fā)生肝硬化的比率無(wú)顯著性意義(p＞ 0.05);在 88.7mg/L＜CG＜293.2mg/L及 CG＜88.7mg/L組中,因觀察病例較少,不能說(shuō)明問(wèn)題。在這項(xiàng)研究中,CG＞293.2mg/L組在性別方面無(wú)顯著性差異與 Schmidt等[7]人存在分歧,與Kayali Zeid等[3]的結(jié)果相一致。由于男性通常被認(rèn)為是進(jìn)行性肝臟疾病的一個(gè)危險(xiǎn)因素,因而CG與肝纖維化發(fā)展的臨床和分子學(xué)關(guān)系需進(jìn)一步研究。

5 血清 CG定量與其他肝纖維化指標(biāo)相關(guān)性分析 ,見表 5。

表5 CG與肝硬化指標(biāo)相關(guān)性分析

討 論

冷球蛋白(Cryoglobulin,CG)是血清中存在的30℃易于聚合、4℃沉淀、37℃溶解的病理性免疫球蛋白。根據(jù)免疫球蛋白(Ig)的組成和冷球蛋白血癥患者的冷球蛋白的特性將冷球蛋白分為 3型[9]:I型由單一的單克隆 Ig組成;II型由單克隆的 IgM和多克隆的IgG組成;III型由多克隆的IgM和多克隆的IgG組成,單克隆和多克隆 IgM具有類風(fēng)濕因子(RF)活性,II型和 III型冷球蛋白血癥又稱為混合型冷球蛋白血癥(Mixed cryoglobulinemia,MC)。

20世紀(jì) 80年代末發(fā)現(xiàn) HCV以來(lái),丙肝與冷球蛋白血癥的關(guān)系迅速得到公認(rèn);丙肝病毒的包膜蛋白 E2可以與一種細(xì)胞膜蛋白 CD81結(jié)合,在B細(xì)胞上,CD81與 CD19、CR2、M HC II類分子存在聯(lián)系,當(dāng) HCV與CD81結(jié)合后,可激活上述分子形成的復(fù)合物,降低抗體產(chǎn)生所需的抗原閾,使 B細(xì)胞反應(yīng)性增高,導(dǎo)致在骨髓和肝臟中形成產(chǎn)生 II型冷球蛋白的優(yōu)勢(shì) B細(xì)胞克隆,這可能是 HCV感染易合并MC的機(jī)制[7,10]。

肝纖維化是肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分過(guò)度增生與異常沉積,導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)或功能異常的病理過(guò)程,結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為肝竇毛細(xì)血管與肝小葉內(nèi)以及匯管區(qū)纖維化;功能上可以表現(xiàn)為肝功能減退、門靜脈高壓等。丙肝病毒感染后,很多病人發(fā)展成為持續(xù)性病毒血癥和肝纖維化,肝纖維化可進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化。

伴發(fā)冷球蛋白血癥的 HCV感染導(dǎo)致肝纖維化的分子機(jī)制正成為研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)獲得的數(shù)據(jù)顯示細(xì)胞介導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)有可能是導(dǎo)致肝臟纖維化的原因。宿主免疫反應(yīng)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞和肝細(xì)胞釋放旁分泌因子,誘導(dǎo)肝竇內(nèi)肝星狀細(xì)胞的活化,膠原等ECM成分代謝失衡,生成大于降解,促使肝臟 ECM沉積與結(jié)構(gòu)重構(gòu)[11]。肝纖維化的診斷迄今仍以肝組織病理學(xué)檢查最為可靠,由于肝穿活檢為創(chuàng)傷性檢查,所取標(biāo)本有其局限性,難以常規(guī)用于隨訪和動(dòng)態(tài)觀察。近20年來(lái),對(duì)肝纖維化的血清學(xué)綜合診斷取得顯著進(jìn)展[12]。透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原肽或其代謝片段(包括 PⅢ P或 PCⅢ )、Ⅳ型膠原或其代謝片段(包括ⅣC、Ⅳ 7S、Ⅳ NC1)及層粘蛋白 (LN)構(gòu)成正常肝臟結(jié)締組織“功能性”基底膜。當(dāng)肝臟發(fā)生纖維化時(shí),ECM較正常肝增加 2～ 20倍 ,HA、 PⅢ P或 PCⅢ、Ⅳ C、Ⅳ 7S、ⅣNC1及 LN可作為肝纖維化的標(biāo)志物,用于肝纖維化的診斷,這些標(biāo)志物均須放免法檢測(cè)。

我們對(duì)68例臨床確診HCV感染及23丙肝肝纖維化患者血清 CG、HA、PCⅢ、PCⅣ、LN指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果表明CG定量檢測(cè)在單純 HCV感染及丙肝肝硬化中均顯著高于對(duì)照組,且隨年齡、病程、纖維化程度的發(fā)展而增高;與肝纖維化標(biāo)志物 HA、PCⅢ、PCⅣ、LN具有良好的相關(guān)性。并且,CG檢測(cè)在肝纖維化分級(jí)中,具有重要意義,提示 CG與肝纖維化活動(dòng)密切相關(guān)。因此,CG定量檢測(cè)可以作為判斷慢性HCV感染有無(wú)肝纖維化的指標(biāo),并能監(jiān)測(cè)慢性丙型肝炎肝纖維化的動(dòng)態(tài)變化。

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