Th17類細胞因子在潰瘍性結腸炎患者中的表達

何英 李春明 單景軍 蔣萍

(黑龍江省哈爾濱市第一醫院消化科,*病理科,黑龍江 哈爾濱 150010)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一類病因不明的胃腸道慢性非特異性炎癥,屬于自身免疫病的一種,近年來其發病率不斷增加,已成為消化系統常見疾病和慢性腹瀉的主要病因[1]。目前普遍認為該病發病主要由免疫反應介導,并與遺傳因素、環境因素密切相關,免疫調節紊亂是本病發病的關鍵因素[2-3]。近年來新發現一種新的CD4+輔助T細胞亞群Th17細胞亞群,該細胞亞群主要分泌白介素-17(IL-17)[4]。目前研究[5-6]認為Th17細胞在自身免疫性疾病發病中起關鍵性作用。本研究檢測IL-17在潰瘍性結腸炎患者中的表達及其與疾病活動指數的相關性,探討Th17細胞在UC發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 實驗組選擇自2008年1月—2009年10月哈爾濱市第一醫院25例確診為潰瘍性結腸炎的門診及住院患者,診斷均符合2007年《對我國炎癥性腸病診斷治療規范的共識意見》中的診斷標準[7]。其中男性12例,女性13例,年齡18～70歲,輕度UC患者7例,中度 UC患者14例,重度UC患者4例。對照組為10例單發性結腸或直腸息肉患者,對照組與UC組的年齡、性別構成無顯著差異(P＞0.05)。

1.2 實驗材料 實驗組在結腸鏡下選擇病變最顯著腸段的結腸黏膜3塊活檢,對照組取距單發性息肉5 cm以上的正常腸黏膜3塊活檢。另外實驗組和對照組患者均清晨空腹取外周血。

1.3 主要試劑 IL-17ELISA試劑盒購自晶美生物工程有限公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體為武漢博士德公司產品;IL-17抗體購自Santa Cruz公司。

1.4 方法

1.4.1 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清IL-17 分離血清后嚴格按照試劑盒說明操作,終止反應后在450 nm處讀取各孔吸光度值,以各孔OD值為縱坐標,以標準品的濃度為橫坐標繪制標準曲線,根據樣品OD值查找對應的濃度。

1.4.2 免疫組化檢測結腸黏膜IL-17表達 活檢標本常規甲醛固定,石蠟包埋,并將石蠟塊進行連續切片用于免疫組化檢查。石蠟切片常規脫蠟進水,3%甲醇室溫孵育以清除內源性過氧化物酶的活性,用0.01 mmol?L-1,pH為6.0枸椽酸鹽緩沖液孵育進行熱抗原修復,10%正常羊血清封閉,一抗為兔抗人IL-17抗體(稀釋濃度為1:100),4℃過夜,滴加生物素標記的羊抗兔二抗工作液,37℃溫箱孵育20min,滴加辣根酶標記的鏈霉素卵白素室溫孵育40min,DAB顯色,蘇木素復染,脫水,透明,封片。每次以PBS緩沖液代替一抗作空白對照。陽性細胞為細胞質或細胞核中出現棕黃色顆粒沉淀。每張切片均應用醫學彩色圖像分析系統進行掃描分析,每張切片隨機取5個染色較好的不重復的視野,取其光密度的均值作為該切片的實驗結果,留待統計分析。

1.4.3 疾病活動指數(DAI)的評估 每日讓UC患者記錄大便性狀和隱血情況,按表1進行評分。結腸鏡下黏膜外觀由多名內鏡醫師共同經過盲法閱片,醫師總體評價亦由多名臨床醫師共同評價,保證判斷的準確性。

表1 潰瘍性結腸炎患者疾病活動指數(DAI)評分

1.5 統計學處理 數據采用SPSS13.0軟件包進行處理,計量資料采用均數加減標準差表示,兩組間比較采用t檢驗,兩組間相關分析采用方差分析檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ELISA法檢測血清IL-17結果 25例UC外周血中 IL-17平均濃度為(13.62±2.37)ng?mL-1,10例正常對照組外周血中IL-17平均濃度為(10.98±3.67)ng?mL,兩組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 免疫組化檢測結腸黏膜IL-17表達結果 IL-17主要在結腸黏膜固有層的炎細胞(如淋巴細胞、漿細胞、中性粒細胞)表達,UC組與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05),(圖1)。

圖1 各組患者腸黏膜 LI-17的表達(免疫組織化學染色×100)

2.3 IL-17與疾病活動指數的相關性 按DAI評分將UC患者分成輕、中、重3組,IL-17與DAI評分呈正相關。IL-17在輕、中、重3組中的表達分別是15.31%±2.01%;35.43%±3.31%;41.98%±4.65%。輕度與中度UC患者相比,P＜0.05;中度與重度相比,P＜0.05。

3 討 論

UC病因未明,CD4+輔助T細胞在UC發病中的作用已經得到公認[8]。傳統的CD4+輔助性T細胞主要分為兩個亞群:Th1細胞亞群和Th2細胞亞群。既往人們認為Th1細胞和Th2細胞失衡是造成UC發病的主要原因,但是還是有許多令人無法解釋的現象。Th17細胞亞群是近幾年才得到肯定的一類CD4+T細胞亞群,其分泌的主要細胞因子IL-17能有效地介導中性粒細胞動員的興奮過程,從而有效地介導了前炎性反應,誘導促炎細胞因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶的表達,引起組織細胞浸潤和組織破壞。IL-17可以誘導固有免疫炎癥細胞因子、急性反應蛋白、粒-巨細胞刺激因子(GCSF)和前列腺素E2等表達,還與炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等有協同作用,放大加強其致炎效應[9]。許多炎性疾病,如類風濕性關節炎、多發性硬化癥、系統性紅斑狼瘡、哮喘及同種排異反應患者的病變組織中都能檢測到IL-17。體內實驗證明,高水平IL-17與多種自身免疫病發病機制有關[10]。本研究用免疫組化的方法檢測 UC結腸黏膜IL-17的表達水平,在UC患者結腸黏膜中IL-17表達較正常人顯著增加。Ogawa[11]應用抗-CD3或抗-CD68與抗-IL-17進行雙重染色,發現T細胞和單核/巨噬細胞是炎癥性腸疾病患者炎癥局部IL-17的來源。這與IL-17的生物學特性一致,因此,可以說來源于T細胞和單核/巨噬細胞的IL-17可以誘導并維持UC黏膜炎癥應答。并證實了IL-17表達與疾病活動指數呈正相關。局部IL-17濃度的高低也反映了UC的炎癥嚴重程度。本實驗未發現外周血IL-17表達增高,說明Th17細胞因子主要作用于病變局部而非全身,進一步證明了記憶性T淋巴細胞介導的免疫反應具有組織器官的靶向性[12]。而IL-17主要由記憶性T淋巴細胞產生,某一部位的IL-17升高能誘導相應部位的炎性反應,具有部位的專一性[13]。因此,通過本實驗可以推測Th17細胞與UC發病有密切關系。近年來通過分子標靶技術阻斷炎癥、免疫途徑治療UC的理念取得了較大進展[14-15],局部阻斷 Th17細胞的分泌可以成為治療UC的一種手段。

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