黃芪甲苷對體外炎癥狀態下單核細胞NF-κB及糖皮質激素受體表達的影響

冀曉俊 李昂 段美麗 張淑文

(首都醫科大學附屬友誼醫院重癥醫學科,北京 100050)

核因子κB(NF-κB)是一種廣泛存在的核轉錄因子,在炎癥刺激時促進多種細胞因子的基因轉錄,在細胞因子介導的炎性反應中起重要作用,在炎性反應復雜的細胞因子網絡中,NF-κB的活化可能是一個中心環節[1-2]。糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor,GR)是核受體超家族成員,它作為一種配體活化轉錄因子發揮作用。GC廣泛存在于人和哺乳動物的各種有核細胞中,其作用是介導糖皮質激素在細胞內發揮生物效應。激活的GR通過直接與NF-κB的制了NF-κB的活性而抑制了多種細胞因子(IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 和 TNF),一些和炎癥相關的酶(COX-2,iNOS)及某些黏附分子(ICAM-1,E-selectin,V-CAM)的轉錄[3],從而起到抑制炎性反應的作用。

嚴重膿毒癥的抗炎治療目前仍是一個有待解決的難題,開發新的抗炎治療藥物對控制全身炎性反應,降低膿毒癥病死率具有重要意義。越來越多的臨床實踐及基礎研究證實,一些傳統中藥具有明確的抗炎作用。黃芪被認為具有良好的抗炎作用[4]。已證實黃芪的多種分離物均有不同程度抗炎作用,其中以黃芪甲苷作用尤為顯著。本研究觀察黃芪甲苷對炎癥狀態下單核細胞中NF-κB及糖皮質激素受體表達水平的影響,進而推測黃芪甲苷可能的藥理機制。

1 資料與方法

黃芪甲苷由中國科學院蘭州化物所進行提純分離,純度為97.6%;實驗中首先用DMSO將藥物完全溶解,然后再溶解于DMEM培養基(DMSO濃度不超過1%),之后使用0.22μm 濾器過濾除菌,保存于4℃。

Wistar大鼠(購自中國醫學科學院實驗動物研究所,許可證編號:SCXKII-07-0012);RPMI-1640培養基(Gibco公司);胎牛血清(北京元亨圣馬公司);脂多糖(北京碧云天生物技術研究所;編號:E coli,0111:B4);GR、TNF-α、NF-kB 抗體、全蛋白提取試劑盒、Western Blotting ECL試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;尼龍膜(Schleicher&Schuell公司);PVDF膜(Immobilon TM-P,Millipore公司);CO2孵箱(SANYO MCO-17AI);PCR儀(PTC-200型);超凈工作臺(SG-400);高速低溫離心機(Sorvall ST-21)。Western blot電泳儀(美國Bio-Rad);Western轉膜儀(BioRad);凝膠成像系統(Gel-Doc1000,美國Bio-Rad)。

1.1 實驗分組

在25 cm2細胞培養瓶中分組培養單核細胞,分為:①正常單核細胞對照組(NC);②黃芪甲苷對照組(AS);③脂多糖對照組(LPS);④糖皮質激素實驗組(LPS+Dex);⑤黃芪甲苷實驗組Ⅰ(LPS+As);⑥黃芪甲苷實驗組Ⅱ(LPS+As+Dex)。實驗中,脂多糖濃度為:100μg?L-1(此濃度下作用72 h,細胞死亡率接近95%),黃芪甲苷濃度為:100 mg?L-1(黃芪甲苷95%有效量,ED95)。

1.2 反轉錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法檢測黃芪甲苷對糖皮質激素受體和細胞因子表達量的影響

在25 cm2細胞培養瓶中分組培養單個核細胞;培養48 h以后,收獲細胞;用1×PBS洗滌細胞3次;用T RIZOL提取細胞總RNA;以分光光度計定量細胞總RNA后;擴增目標細胞因子特異片段,最后Image ProPlus軟件進行灰度分析。引物設計見表1。

1.3 Western blot方法檢測黃芪甲苷對糖皮質激素

配膠完成后,將樣品細胞去培養液后用PBS沖洗2～3遍;加入適量冰預冷的裂解液對細胞進行裂解并定量;將不同分組細胞的蛋白樣品調整至等濃度后,依次上樣電泳、轉膜、封閉及雜交,最后使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發光法進行顯色。

表1 RT-PCR實驗中引物序列

2 結 果

2.1 脂多糖刺激單個核細胞后,黃芪甲苷對脂多糖刺激細胞后相關基因mRNA表達的情況(圖1)

結果發現:①LPS刺激后糖皮質激素受體-α mRNA表達量有所下降,加激素組與單純LPS刺激組比較無明顯差異,黃芪甲苷可使糖皮質激素受體-αmRNA表達量表達顯著增加;②LPS刺激后糖皮質激素受體-β mRNA表達顯著增加,加激素或黃芪甲苷后與單純LPS刺激比較均無明顯差異;③LPS刺激后NF-kB mRNA表達顯著增加,加激素或黃芪甲苷后與單純LPS刺激比較均無明顯差異;④LPS刺激后TNF-αmRNA表達增加,地塞米松能抑制其表達,單用黃芪甲苷對其表達也具有抑制作用,聯合激素和黃芪甲苷對其抑制作用更明顯。

2.2 脂多糖刺激單個核細胞后,黃芪甲苷對脂多糖刺激細胞后相關蛋白表達的情況

分組后,提取細胞蛋白,通過Western blot方法檢測下述蛋白(GR 、TNF-α、NF-κB)的表達 ,以 Actin作為內參(圖2)。成像后通過Image ProPlus軟件進行灰度分析,并統計數據,制成柱形圖。

圖2顯示,蛋白含量檢測結果與mRNA檢測結果基本一致。此外,還可以明顯看出:正常細胞GRβ蛋白表達極低,其表達水平明顯低于GRα,LPS刺激后GRβ的表達明顯上升,相比之下,GRα無明顯變化。

3 討 論

黃芪主要含有黃芪苷(astragaloside)I、II、IV 等皂苷類、黃酮類、氨基酸類、多糖類、生物堿等[5]。為明確其中主要抗炎成分,我們經初篩實驗,發現黃芪甲苷能明顯保護體外炎癥狀態下的單核細胞。為進一步探索黃芪甲苷的保護機制,本實驗主要研究了黃芪甲苷對NF-κB和糖皮質激素受體及細胞因子TNF-α表達水平的影響。

GR是作為糖皮質激素(glococorticoid,GC)配體發揮作用的主要受體。與激素結合后,活化的GR進入細胞核,以同源二聚體的形式與特異的DNA序列糖皮質激素反應元件(glucocorticoid responsive element,GRE)結合,調節靶基因轉錄表達。GR-GC復合體主要通過阻斷NF-κB活化而抑制炎性反應[6]。NF-κB是一種廣泛存在的核轉錄因子,被認為是炎性反應的主要驅動因子,涉及到100多種基因的轉錄,包括 IL-1、IL-6、TNF-α等。在無外界刺激時,NF-κB雜二聚體與抑制蛋白IκB結合,并與PKA的催化亞基(PKAC)結合,呈非活性狀態,位于胞質中。當暴露于脂多糖、細胞因子(IL-1、TNF-α)、紫外線輻射、氧自由基等許多外界刺激下,NF-κB活化。活化的NF-κB與GR通過蛋白間相互作用,阻斷DNA結合及隨后的轉錄活性而起到相互抑制作用[7]。

本實驗結果提示:LPS刺激后GR-α水平有所下降,黃芪甲苷可使GR-α表達顯著增加;LPS刺激后NF-kB及TNF-α表達顯著增加,激素及黃芪甲苷均對 NF-kB表達無明顯影響,但激素能抑制TNF-α表達,單用黃芪甲苷對其表達也具有抑制作用,聯合激素和黃芪甲苷對其抑制作用更明顯。這一結果通過Western blot和RT-PCR方法在蛋白水平和mRNA水平都得到驗證。由此可見,黃芪甲苷能顯著增加GRα的表達,與激素聯合能顯著抑制細胞因子TNF-α的產生,在細胞水平具有明顯抗炎作用;本研究表明黃芪甲苷增加炎癥狀態下細胞的GR表達可能是其發揮抗炎作用的關鍵機制。

GR有不同的亞型,不同型的GR可介導不同的生物學過程。GRα和GRβ生物學活性存在差異,GRα在靜息狀態下主要定位于胞漿,其活性依賴于配體的存在,在胞漿與糖皮質激素結合后進入細胞核,以同源二聚體的形式與特異的DNA序列糖皮質激素反應元件(glucocorticoid responsive element,GRE)結合,調節靶基因轉錄表達。同時,GRα還以二聚體或單體的形式和其他核轉錄因子結合,通過直接的蛋白-蛋白相互作用調節它們的功能。與GRα相比,GRβ不能與糖皮質激素作用,靜息狀態下主要分布在胞核內,GRβ能與GRα以異二聚體形式結合GRE,從而抑制GRα的活性,對GRα起著負調節作用[8]。由于GRβ蛋白的半衰期是GRα蛋白的2倍,因此,一些促炎癥細胞因子刺激將誘導GRβ不成比例地(相對于GRα)堆積。

本研究并未顯示LPS作用單核細胞后出現GRα數量明顯下降。但本研究顯示正常細胞GRβ蛋白表達極低,幾乎測不到,其mRNA水平明顯低于GRα,而在 LPS刺激后GRβ的表達明顯上升,相比之下,GRα的表達無明顯變化。由此可見,LPS刺激下GRβ表達水平上調可能是嚴重感染時出現外周糖皮質激素抵抗的機制之一。

1 Baeuerle PA,Baltimore D.NF-κB:ten years after[J].Cell,1996,87:13-20.

2 Maniatis T.Catalysis by a multiprotein IkappaB kinase complex[J].Science,1997,278:818-819.

3 Christman JW,Lancaster LH,Blackwell TS.Nuclear factor κB:a pivotal role in the systemic inflammatory response syndrome and new target for therapy[J].Intensive Care Med,1998,24:1131-1138.

4 Zhang WJ,Hufnaql P,Binder BR,et al.Antiinflammatory activity of astragaloside IV is mediated by inhibition of NF-κB activation and adhesion molecule expression[J].T hromb Haemost,2003,90(5):904-914.

5 Hu JY,Han J,Chu ZG,et al.Astragaloside IV attenuates hypoxia-induced cardiomyocyte damage in rats by upregulating superoxide dismutase-1 levels[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2009,36(4):351-357.

6 Zhang ZC,Li SJ,Yang YZ,et al.Effect of astragaloside on cardiomyocyte apoptosis in murine coxsackievirus B3 my ocarditis[J].J Asian Nat Prod Res,2007,9(2):145-151.

7 Mckay LI,Cidlowski JA.Molecular control of immune/inflammatory responses:Interactions between nuclear facto r-kappa B and steroid receptor-signaling pathways[J].Endocr Rev,1999,20:435-459.

8 Bamberger CM,Bamberger AM,de Castro M.Chrousos GP:Glucocorticoid receptor beta,a potential endogenous inhibitor of glucocorticoid action in humans[J].J Clin Invest,1995,95:2435-2441.