基質金屬蛋白酶-9和腫瘤壞死因子α在大鼠光氣吸入性肺損傷中的表達及意義

張琳 申捷 黃文彬 何岱昆

(復旦大學附屬金山醫院化學傷害醫療救治中心,上海 200540)

光氣是無色,具有爛干草味的窒息性氣體,是重要的化工原料,廣泛用于橡膠、塑料、染料、農藥、醫藥等領域。在第一次世界大戰期間,光氣曾被用作軍事毒劑。因此,聯合國裁軍委員會將光氣定為“雙用途毒劑”[1]。由于光氣用途廣泛,人們對其接觸機會多,常因防護不當或意外泄露而致人員中毒,導致急性肺損傷(acute lung injury,ALI),甚至發展成急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),危及生命。但目前光氣對人體的中毒機制尚不清楚[2],中毒后特效療法,故研究光氣中毒機制具有重要意義。

基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)又稱明膠酶B[3],是基質金屬蛋白酶家族中的一種,可由多種炎性細胞產生,包括中性粒細胞、肺泡巨噬細胞以及結締組織細胞。本實驗建立大鼠光氣吸入性肺損傷的模型,采用分子生物學方法探討MMP-9在光氣吸入性肺損傷中的表達和意義及其與腫瘤壞死因子α(TNF-α)的關系 。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組 取SPF級SD大鼠50只,雌雄各半,體質量180～220 g,由第二軍醫大學實驗動物中心提供。隨機分為空氣對照組(10只)和光氣染毒后 2、4、6、8 h 組(每組各10只),分別記為O、A、B、C、D組。光氣染毒組置于動態染毒柜中,導入濃度為 8.33 mg?L-1的光氣(光氣純度為100%,由固體三光氣溶于環己烷在N,N-二甲基甲酰胺作用下產生,染毒方法根據文獻[4]略做改動)染毒5min;對照組動物置于染毒柜內,除導入同樣流量的空氣之外,其余條件與染毒組完全相同。

1.2 病理組織學檢測 實驗動物經腹腔注射20%烏拉坦(1mL?kg-1)麻醉,心臟穿刺放血處死。開胸取右中上肺,4%甲醛固定,石蠟包埋,4μm切片,HE染色,光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.3 肺損傷的評價 ①肺濕/干質量(W/D)比值取右下肺,輕輕擦干表面,立即稱質量記為肺濕質量。然后置于80℃烤箱內,48 h后稱質量記為肺干質量,計算濕/干質量比值。②支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白濃度 處死大鼠后立即行氣管插管,結扎右側主支氣管,以37℃0.9%氯化鈉液對左肺行支氣管肺泡灌洗,連續灌洗3次。收集灌洗液5mL于4℃800×g離心10min,回收上清液置于-20℃冰箱待檢測蛋白含量。Lowry法測定蛋白含量。③支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞數目用血球計數板計細胞總數后,將灌洗液4℃3000 r?min-1離心10min,上清液置于-20℃保存待生化測定,沉渣用于做細胞涂片,Wright-Giemsa染色,進行細胞分類(至少計數200個細胞),計算總細胞數目。

1.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)法測定BALF中TNF-α和MMP-9含量 操作步驟嚴格按照各試劑盒說明書進行,酶標溶解度波長以450 nm讀取吸光值,按標準曲線計算對應的吸光值。TNF-α和MMP-9放射免疫盒均由由美國R&D systems公司生產。

1.5 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)檢測MMP-9 mRNA水平 取左肺置于-70℃冰箱保存。用T rizol試劑(美國Invitrogen公司)從肺組織中提取總RNA。引物由上海賽百盛公司合成。MMP-9引物序列:上游引物 5′T TCAAGGACGGACGGTCGGTAT T3′,下游引物5′CTCTGAGCCTAGACCCAACTTA3′,產 物 為228 bp cDNA片斷。β-Actin引物序列:上游引物5′CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3′,下游 引物 5′TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT 3′

具體步驟:(1)DNA酶處理完全去除殘留DNA。(2)反轉錄生成cDNA。(3)以cDNA為模板做PCR擴增。反應程序:95℃5min,95℃30 s,48℃30 s,72℃30 s(60循環)。然后進行Real time PCR反應。

為了建立PCR產物的熔解曲線,擴增反應結束后繼續從72℃緩慢加熱到99℃(每5 S升高1℃)實時定量PCR時各樣品加樣量均為2μL,然而由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉錄效率誤差等的影響,每個樣品取2μL體積的cDNA含量并不完全相同,為校正此差異,我們使用管家基因β-actin作為內參,以樣品待測基因得值除以此樣品內參得值,最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量。

1.6 統計學方法 用SPSS11.0進行統計學分析。實驗數據均以均數±標準差的形式表示,組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 觀察 實驗中觀察到染毒組大鼠雙足撓鼻,呼吸急促,心率加快,取肺可觀察到雙肺膨脹,體積增大,質量增加,色澤暗紅,表面有明顯出血點,氣管插管時可見粉紅色泡沫液體溢出,光鏡下觀察到肺組織結構顯著改變,肺間質和肺泡腔內有大量的紅細胞漏出和炎性細胞浸潤,肺間質水腫增厚。對照組大鼠肺組織表面無出血點,光鏡下肺組織結構完好,肺泡腔內無細胞滲出,肺間質清晰。病理觀察見圖1～2。

2.2 肺濕/干質量比和BALF中蛋白含量及中性粒細胞數目 動物染毒后肺濕/干質量比和支氣管肺泡灌洗液中的蛋白含量逐漸增大,表明肺水腫逐漸加重,各組與對照組有明顯差異(P＜0.05),見表1。

表1 光氣染毒后肺濕/干質量比和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的變化

2.3 BALF中 TNF-α和MMP-9含量 見表2。

表2 BALF中 TNF-α和MMP-9含量

2.4 RT-PCR結果分析 結果顯示,對照組大鼠肺組織中也有MMP-9 mRNA的微量表達,以對照組大鼠肺組織中MMP-9 mRNA的表達含量設為1,染毒組大鼠較對照組MMP-9 mRNA的表達含量顯著增高(P＜0.01),染毒組大鼠MMP-9 mRNA的表達含量隨時間延長進一步增多,差異有統計學意義(P＜0.01)。光氣染毒后8h組MMP-9mRNA的表達量較其他各組顯著增高(P＜0.01)。見圖3～4。

圖3 MMP-9 mRNA相對表達量

圖4 M MP-9 mRNA相對表達量比較

3 討 論

本實驗發現大鼠吸入光氣2 h后即出現典型ALI表現,主要表現為光氣致傷大鼠整個肺充血,表面可見斑片狀或者點狀的出血灶;光鏡下顯示肺間質水腫,彌漫性出血,肺泡內可見大量紅細胞滲出和中性粒細胞、血漿蛋白浸潤;肺濕/干質量、肺泡灌洗液中性粒細胞數、蛋白含量以及肺血管的通透性均較對照組明顯增高(P＜0.05)。實驗表明,在光氣所致的急性肺損傷中不僅血管內皮細胞存在一定程度的損傷,而且肺泡上皮也受損,致使大量的蛋白和中性粒細胞等血管內容物滲漏到肺泡腔內,致肺泡灌洗液中蛋白含量和中性粒細胞數顯著升高,肺濕/干質量比增加,表明肺水增加,這些變化均符合ALI的生物標志(肺水增加、肺毛細血管通透性增加、肺泡灌洗液中的中性粒細胞數和蛋白濃度增加等改變)。實驗結果證明,隨光氣染毒后時間的延長,肺組織損傷加重,這證實光氣中毒可引起的遲發性肺水腫。

光氣經人體吸入后經一定潛伏期(最長24 h)可導致肺水腫甚至急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),其主要病變是中毒性肺水腫,中毒機制假說頗多,包括諸如酰化作用、直接作用、鹽酸作用、神經反射作用、肺血流動力學改變等,各有實驗依據。但任何一種假說都不能完滿地解釋肺水腫發生與發展過程。

MMP是一組在結構上具有極大同源,能降解細胞外基(ECM)蛋白的內切酶的總稱,MMP-9是其中一種,可以通過以下作用參與肺損傷過程:①MMP-9直接作用于肺泡毛細血管基膜,使其通透性增加。MMP-9還可以水解血管內皮細胞的鈣黏附素(cadherin)和閉合蛋白(occludin)這兩種細胞之間的連接結構直接導致微血管通透性增加[5]。②MMP-9通過調節細胞因子的水平,從而參與ALI的發生、發展。MMP-9可將相對分子質量為26 kDa的TNF-α前體裂解成具有活性形式的、成熟的相對分子質量為17 kDa的TNF-α[6]。③MMP-9通過增加彈性蛋白酶的活性而間接促使ECM及基膜的損傷。④降解肺泡毛細血管基底膜的主要成分Ⅳ型膠原,加重肺水腫。

MMPs是一組鋅離子依賴性內肽酶,通過介導細胞外基質降解,參與正常發育、組織重建、修復、細胞遷移、血管生成、炎性反應、腫瘤侵襲和轉移等過程。在正常情況下,MMPs表達量很少,但活化的中性粒細胞可釋放大量的MMP-9。肺泡毛細血管基底膜的損害是以細胞外基質的變化為基礎。MMP-9的過度激活和表達,導致大量細胞外基質(extracellularmatrix,ECM)成分降解,基底膜破壞,通透性增加,炎性細胞浸潤,引起ARDS。Chetty等[7]也證實MMP-9參與了高氧誘導的新生小鼠急性肺損傷,并隨損傷的加重MMP-9的表達明顯增強。MMP-9還可能通過降解肺組織中的彈性纖維造成肺組織彈性支持作用減低,結構破壞;同時,MMP-9降解的細胞外基質片段對炎性細胞還有趨化作用,可放大肺組織局部的炎性反應,進一步加重了肺實質的毀損。Fligiel等[8]對28例ALI/ARDS患者支氣管肺泡灌洗液進行分析,結果顯示MMP-9,MMP-8,MMP-2均增高。張向峰等[9]建立小鼠高氧環境下急性肺損傷模型,RT-PCR方法證明MMP-9 mRNA在高氧引起的肺損傷中表達增多。Kim等[10]發現在博來霉素引起的肺損傷中發現肺組織和BALF中MMP-9和MMP-2均升高,MMP-9升高更明顯,早期主要起肺損傷作用,晚期肺組織中MMP-9和MMP-2也升高,起肺組織損傷修復作用,導致肺纖維化。劉新等[11]研究發現,異丙酚可產生與抑制MMP-9活性相關的肺保護作用。本實驗通過建立大鼠光氣吸入性肺損傷動物模型,證明與空氣對照組相比,光氣損傷組BALF中MMP-9及TNF-α的含量明顯增加,MMP-9在光氣染毒組中表達較對照組明顯增多(P＜0.01),并隨時間延長,MMP-9mRNA的表達顯著增加,證明MMP-9與光氣吸入性肺損傷程度存在相關性。

MMP-9在光氣吸入性肺損傷中的確切機制目前尚未見報道,本實驗證明MMP-9被激活后導致大量炎性細胞因子過度表達和中性粒細胞活化致傷是引起ALI發生發展的共同軸心環節。通過本實驗,我們認為光氣吸入性肺損傷的可能機制為:(1)光氣吸入導致中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞在肺部扣押,引發全身炎性反應綜合征(SIRS)。(2)激活的炎性細胞和釋放的炎性介質使MMP-9的表達含量上調,降解肺泡毛細血管基底膜,使其通透性增加,肺間質結構顯著紊亂,肺水腫形成。(3)鈉-鉀ATP酶活力受到抑制,肺組織清除氧自由基的能力明顯下降[12]。氧化物質大量生成能直接切斷MMP-9的cys-Zn2+間的配心暴露而激活,從而發揮其損傷作用。

MMP-9可以通過多種途徑參與光氣吸入性肺損傷,并與眾多細胞炎性因子如TNF-α之間存在正反饋,促進炎癥進展。在發生ALI后,早期應用MMP-9抑制劑,如地塞米松,烏司他丁抑制MMP-9活性可能會減輕肺損傷的程度[13]。在光氣引起的肺損傷中,目前尚需相關動物實驗和臨床研究證明。通過研究細胞因子與MMP-9之間的信號傳導通路可進一步了解MMP-9在光氣吸入性肺損傷中的作用,同時在臨床研究中對光氣中毒患者MMP-9進行評價,并觀察MMP-9與其相關性,以期進一步探討光氣吸入性肺損傷的發病機制。

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