C反應蛋白基因多態性與原發性高血壓病的關系

孔紅 金玥雯 肖冰 姬開達 朱鼎良 高平進,2 張怡

(1.上海市高血壓研究所,上海 200025;2.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院高血壓科,上海 200025)

C反應蛋白(C reactive protein,CRP)是一種炎癥和組織損傷的標志物。近年來眾多研究[1-2]證實CRP參與了心血管疾病的發生,同時它也可作為一個有預測價值的心血管危險指標。CRP水平受年齡、吸煙、體質量指數等多種因素的影響。最近研究[3-4]顯示CRP的遺傳度在27%～40%,提示CRP基因的變異也可能會對CRP水平產生影響,其中CRP基因 rs1205、rs1130864、和 rs1800947多態已被較多研究[5-7]證實與CRP濃度有關。

高血壓病患者的血管壁一般都有炎性反應,已知這種炎性反應參與了高血壓病的發生、發展,但CRP是否可作為高血壓病的危險因子尚無定論,CRP基因變異與原發性高血壓病的相關性也鮮有報道。

本研究在原發性高血壓病患者和正常血壓者對照組進行CRP基因3個單核苷酸多態性(SNP)位點rs1205、rs1130864、和 rs1800947 的基因分型、單倍型分析及超敏C反應蛋白(hs-CRP)濃度的檢測,以探討CRP基因多態性與原發性高血壓之間的關系。

1 資料與方法

1.1 對象和分組 共1384名受試者,均來自中國上海地區。其中712名為原發性高血壓病患者(EH組),均為漢族,無親緣關系;對照組(NT組)為672名年齡和性別與EH組匹配的血壓正常者。高血壓定義為收縮壓(SBP)≥140 mmHg或舒張壓(DBP)≥90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa);排除繼發性高血壓病患者。NT組 SBP＜130 mmHg,DBP＜85 mmHg。測定所有對象的身高、體質量、血清總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)及血尿素氮(BUN)。EH組中有554例檢測了hs-CRP。本研究步驟得到上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院倫理委員會認可;受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般指標及hs-CRP檢測 所有入選者均于清晨空腹采肘靜脈血,用全自動生化分析儀(200FR;T oshiba)測定 TC 、HDL-C、TG 、BUN 。 依據Friedewald公式計算得出低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。采用高敏免疫比濁法檢測 hs-CRP(R&D公司試劑盒)。

1.2.2 血壓測量 患者靜坐10min以上,以水銀柱血壓計按標準方法檢測右上肢肱動脈血壓3次,取差值小于4 mmHg的2次血壓的平均值。

1.2.3 DNA提取 抽取外周靜脈血4mL,EDTA抗凝,紅細胞清洗液2mL洗滌、離心 3次,取沉淀物,再加白細胞裂解液2mL、蛋白酶K 18μg,37℃水浴4 h,加酚、氯仿、乙醇提取白細胞基因組。標化DNA 濃度至5 ng?μL-1。

1.2.4 SNP選擇 選擇 rs1205,rs1130864及rs180094基因位點,已經有報道上述3個位點和心血管疾病的有關聯,且其值和CRP濃度有關聯。所選擇的SNP的詳細信息列于表1。2min;95℃10min;92℃15 s,60℃1min,45個循環;4℃保存。等位基因的區分應用ABI7900高通量熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國)。

1.3 統計學方法 計量數據用均數±標準差表示。每組分別進行Hardy-Weinberg平衡檢驗,P＞0.05則符合Hardy-Weinberg平衡。對照組與EH組的等位基因和基因型頻率比較采用在線的SHEsis軟件完成(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php);Haploview 4.1(www.broad.mit.edu/mpg/haploview)分析各位點的連鎖不平衡程度。多重檢驗應用錯誤檢出率(FDR)方法進行,FDR q值的閾值為0.20。采用SPSS12.0軟件t檢驗分析組間表型差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床資料比較 與NT相比,EH組 BMI、SBP、DBP、血清 TG 和 BUN 較高,而 HDL-C較低(P＜0.05)。兩組年齡,性別,TC和低密度脂蛋白膽固醇(LDL)比較,差異無統計學意義(t檢驗,均P＞0.05)(表2)。

表2 高血壓組與對照組基本資料比較()

表2 高血壓組與對照組基本資料比較()

注:BMI:體質量指數;SBP:收縮壓;DBP:舒張壓;TC:總膽固醇;TG:三酰甘油;BUN:尿素氮;HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇;LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇

指標 EH組(n=712)N T組(n=672) P值性別(男/女) 402/310 349/323 0.094年齡(歲) 54.8±11.6 54.6±6.3 0.588 BMI(kg/m2) 26.2±3.4 23.0±2.6 ＜0.0001 SBP(mmHg) 145.3±20.0 114.4±12.0 ＜0.0001 DBP(mmHg) 89.2±12.9 75.9±7.6 ＜0.0001 TC(mmol?L-1) 4.88±0.93 4.83±0.94 0.301 TG(mmol?L-1) 2.26±1.55 1.36±0.79 ＜0.0001 LDL-C(mmol? L-1) 3.18±0.91 3.15±0.86 0.646 HDL-C(mmo?L-1) 1.28±0.46 1.46±0.35 ＜0.0001

表1 3個入選的SNP的詳細描述

1.2.5 SNP檢測方法 采用TaqMan熒光探針定量PCR,由美國應用生物系統公司提供探針和引物。反應體系總體積5μL,其中 TaqMan通用PCR反應混合液(Master-Mix)2.4μL,探針 0.08μL,DNA 模板(5 ng?μL-1)2.5μL。反應程序:50℃

2.2 單個SNP與EH的關系 兩組3個SNP的基因型分布和等位基因的頻率見表3。在EH組與對照組,3個SNP位點基因型分布和等位基因頻率比較,差異均無統計學意義(均P＞0.05)。

2.3 單倍型分析 rs1205 C/T,rs1130864 A/G這2個基因位點經過連鎖不平衡分析,D'值＜0.85,進行單倍型分析。結果顯示這2個SNP主要組成3種單倍型(表4),其中單倍型H1(C-A)在NT組頻率顯著高于EH組[優勢比(OR)=0.617,95%可信區間(CI)0.429～0.887,P=0.009]。多重檢驗經過FDR校正后,相關性仍然顯著(FDR q≤0.20)。

表3 兩組3個SNP位點基因型分布和等位基因頻率

表4 EH組和NT組單倍型的分布

2.4 EH組單倍型和表型的關系 在EH組中比較CA單倍型和其他單倍型的各種表型,差異均無統計學意義(P均＞0.05)(表5)

表5 EH組CA單倍型和其他單倍型的表型比較()

表5 EH組CA單倍型和其他單倍型的表型比較()

注:BMI:體質量指數;SBP:收縮壓;DBP:舒張壓;TC:總膽固醇;TG:三酰甘油;LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇;hs-CRP:超敏C反應蛋白

指標 CA單倍型(n=55)其他單倍型(n=499) P值性別(男/女) 33/22 315/184 0.046年齡(歲) 61.72±9.57 58.40±11.95 0.649 BMI(kg/m2) 26.18±3.82 26.10±3.25 0.871 SBP(mm Hg) 148.27±24.21145.93±19.46 0.410 DBP(mm Hg) 86.27±14.95 88.56±13.34 0.235 TC(mmol?L-1) 5.11±0.92 4.92±0.90 0.146 TG(mmol? L-1) 1.93±1.08 2.27±1.65 0.133 LDL-C(mmol?L-1) 3.01±0.67 2.81±0.72 0.056 hs-CRP(mg?L-1) 1.13±1.25 1.25±1.72 0.618

3 討 論

CRP于1930年被發現并命名[8],隨后被證實為炎癥的一種非特異但敏感的指標,在急性和慢性炎癥中均參與作用。高血壓病與動脈粥樣硬化有著相似的動脈炎性病理改變,國內臨床研究[9]提示CRP與血管內皮功能不全相關。2001年Bautista等[10]在對30例高血壓病與CRP關系的橫斷面研究中發現,除外其他傳統高血壓病危險因素影響后,CRP水平與EH仍密切相關,并首次明確提出血清h多研究提示CRP濃度與高血壓病發生有關[11-12],hs-CRP在高血壓病多種危險因素中具有較高的敏感性與特異性[13]。

國外許多研究[5-7,14-17]報道CRP的rs1130864、rs1205、和rs1800947單個SNP或單倍型與CRP水平相關,但與冠心病的相關性尚有爭議[15-16],與高血壓病的相關性研究更少見報道。Komurcu-Bayrak等[18]對1138例土耳其人的研究發現,rs3091244、rs1800947、rs1130864、rs1205在女性均與 CRP水平相關,而在男性中 rs3091244和 rs1130864與CRP水平相關;4個SNP組成的單倍型CGCA和TGTG分別與女性和男性CRP水平及高血壓病相關。Schumacher等[19]研究發現rs1130864、rs1800947和rs1205與健康人的CRP水平相關,但與反映動脈硬化的指標——脈搏波速度(PWV)無關。rs1800947及與 rs13411665和rs1130864組成的單倍型CCC在日本人群中與缺血性腦卒中相關[20]。本研究未發現CRP基因rs1205、rs1800947和rs1130864單個位點的基因型頻率及等位基因頻率在原發性高血壓與正常血壓對照組之間存在差異,但單倍型分析顯示CA單倍型在高血壓組和正常血壓對照組之間的差異具有統計學意義。提示多位點的協同作用可能與高血壓病的發生關聯。高血壓病的發生、發展就是一個多基因的參與的復雜過程,單一的基因位點多態性對原發性高血壓的易感性未足以顯示。本研究未觀察到單倍型與hs-CRP的相關性,可能與研究位點較少、單倍型CA在人群中的分布較低、例數較少有關。同時CRP濃度與年齡、性別、吸煙、肥胖、糖尿病、生理活動和其他炎性因子有關,本研究尚未能排除肥胖、血糖、血脂等代謝因素對CRP的影響。

1 Pai JK,Pischon T,Ma J,et al.Inflammatory markers and the risk of coronary heart disease in men and women[J].N Engl J Med,2004,342:836-843.

2 Danesh J,Wheeler JG,Hirschfield GM,et al.C-reactive protein and other circulating markers of inflammation in the prediction of coronary heart disease[J].N Engl J M ed,2004,350:1387-1397.

3 Pankow JS,Folsom AR,Cushman M,et al.Familial and genetic determinants of systemic markers of inflammation:the N HLBI family heart study[J].Atherosclerosis,2001,154:681-689.

4 Dupuis J,Larson MG,Vasan RS,et al.Genome scan of systemic biomarkers of vascular inflammation in the Framingham Heart Study:evidence for susceptibility loci on 1q[J].A therosclerosis,2005,182:307-314.

5 Russell AI,Cunninghame G DS,Shepherd C,et al.Polymorphism at the C-reactive protein locus influences gene expression and predisposes to systemic lupus ery thematosus[J].Hum Mol Genet,2004,13:137-147.

6 Suk HJ,Ridker PM,Cook N R,et al.Relation of polymorphism within the C-reactive protein gene and plasma CRP levels[J].A therosclerosis,2005,178:139-145.

7 Zee RY,Ridker PM.Polymorphism in the human C-reactive protein(CRP)gene,plasma concentrations of CRP,and the risk of future arterial thrombosis[J].Atherosclerosis,2002,162:217-219.

8 Tillett WS,Francis T Jr.Serological reactive in pneumonia with a non protein insomatic fraction of pneumococcus[J].J Exp Med,1930,52:561.

9 孫韜,張象賢,施海明.超敏C-反應蛋白與血管內皮功能不全[J].中國臨床醫學,2006,13(1):10-11.

10 Bautista LE,López-Jaramillo P,Vera LM,et al.Is C-reactive protein an independent risk factor fo ressential hypertension[J].J Hy pertens,2001,19:857.

11 Diaz JJ,Arguelles J,Malaga I,et al.C-reactive protein is elevated in the offspring of parents with essential hypertension[J].Arch Dis Child,2007,92:304-308.

12 Keenig W,Khuseyinova N,Baumert J,et al.Prospective study of hig h-sensitivity C-reactive protein as a determinant of mortality:results from the MONICA/KO RA Augsburg Cohort Study,1984-1998[J].Clin Chem,2008,54:335-342.

13 李艷秀,張怡,牛文全,等.高敏 C反應蛋白在高血壓多種危險因素中敏感性與特異性最高[J].中華高血壓雜志,2009,17:33-36.

14 Suk Danik j,Chasman DI,Cannon CP,et al.Influence of genetic variation in the C-reactive protein gene on the inflammatory response during and after acute coronary ischemia[J].Ann Hum Genet,2006,70:705-716.

15 Kardy s I,de Maat MP,Uitterlinden AG,et al.C-reactive protein gene haploty pes and risk of coronary heart disease:the Rotterdam Study[J].Eur Heart J,2006,27:1331-1337.

16 Miller DT,Zee RY,Suk Danik J,et al.Association of common CRP gene variants with CRP levels and cardiovascular events[J].Ann Hum Genet,2005,69:623-638.

17 Pai JK,Mukamal KJ,Rexrode KM,et al.C-reactive protein gene polymorphisms,CRP levels,and risk of incident coronary heart disease in two nested case-control studies[J].Plos One,2008,3:1395.

18 Komurcu-Bayrak E,Erginel-Unaltuna N,Onat A,et al.Association of C-reactive protein(CRP)gene allelic variants with serum CRP levels and hypertension in Turkish adults[J].Atherosclerosis,2009,206:474-479.

19 Schumacher W,Cockcroft J,Timpson NJ,et al.Association between C-reactive protein genotype,circulating levels,and aortic pulse wave velocity[J].Hypertension,2009,53:150-157.

20 Morita A,Nakayama T,Soma M.A ssociation study between C-reactive protein genes and ischemic stroke in Japanese subjects[J].Am J Hypertens,2006,19:593-600.