白細胞介素10對失血性休克大鼠肺的保護作用

劉 玉,談大海,,唐季春,,尤 杰,楊定清,張 焰,曾因明

(1.江蘇無錫市第四人民醫院麻醉科 214062;2.江蘇省麻醉學重點實驗室,江蘇徐州221002)

失血性休克能夠誘發單核細胞和巨噬細胞的強烈激活,釋放大量的炎性細胞因子IL-1、IL-6以及 TNF-α等,導致急性肺損傷的發生進而可發展成為急性呼吸窘迫綜合征甚至多器官功能不全,最后導致患者死亡[1]。白細胞介素10(IL-10)抑制膿毒血癥時促炎性因子IL-1、IL-6、IL-12以及 TNF-α的釋放,內源性的IL-10在體內調節細胞因子平衡減輕炎性反應方面發揮重要的作用[2-5]。本實驗采用失血性休克大鼠模型,應用外源性重組人IL-10干預,觀察其對失血性休克大鼠血液中促炎性細胞因子表達以及肺炎癥反應程度的影響,并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組 選擇健康雄性SD大鼠24只,體重300～400g,由徐州醫學院實驗動物中心提供。隨機分為3個組(n=8):假失血性休克對照(Control)組、休克(Shock)組和IL-10+休克(IL-10)組。重組人白細胞介素10(rhIL-10),由上海欣百諾生物科技有限公司提供。

1.2 失血性休克模型制作 大鼠于實驗前適應飼養環境7d,采用燈光照明的方法使晝夜時間均為24h,實驗前12h禁食不禁飲。腹腔注射2%戊巴比妥鈉50mg/kg麻醉后,仰臥固定于大鼠手術臺,分離一側股動、靜脈并置入22G套管,股動脈套管留作放血及監測平均動脈壓,股靜脈套管留作注入復蘇液體和放出的血液。通過動脈以0.5mL/min速度放血,使平均動脈壓(MAP)達到50mm Hg,放出的血液儲存于無菌加肝素的容器,通過放出或回輸血液使MAP維持于 35～45mm Hg,持續120min[6]。

大鼠復蘇時采用其放出的自身血液加上等量的生理鹽水溶液,Shock實驗組大鼠在休克起始時皮下注射10 000單位的重組人IL-10(rhIL-10用2mL 0.9%氯化鈉溶解)[6-7],Shock組大鼠在休克起始時皮下注射2mL 0.9%氯化鈉溶液,Control組大鼠僅作動靜脈置管并維持測壓狀態同樣時程,然后拔除動、靜脈置管,結扎血管,縫合切口,放回原飼養場所待其自然清醒和自由飲食。實驗期間以白熾燈照大鼠,保持直腸溫度36.5～ 37.5℃。

1.3 標本制備及檢測

1.3.1 復蘇24h時,放血活殺動物之前,經由左心室采血3mL,1mL作血氣分析,剩余2mL分離血清,按試劑盒說明測定血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。MDA試劑盒、SOD活性檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞比值、肺通透指數及細胞因子測定。大鼠處死后,取全肺,剪開氣管,經氣管插管緩慢注入4℃無菌生理鹽水灌洗2次,每次灌洗量為5mL。將2次回收的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)經雙層無菌紗布過濾后3 000r/min離心15min,取細胞沉淀涂片,顯微鏡下計數肺泡灌洗液中細胞總數及中性粒細胞并計算所占百分比;Lowry法測定BALF和血漿蛋白含量,計算肺通透性指數(BALF蛋白含量/血漿蛋白含量);上清液于-20℃凍存,ELISA法測定灌洗液上清液及血液中IL-1、IL-6及TNF-α含量。IL-1、IL-6及 TNF-α試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產。

1.3.3 肺濕/干重(W/D)比測定 取右下肺葉組織,濾紙沾干肺表面水分,精確稱重后置烤箱60℃干燥至恒重后測定肺臟干質量,計算肺濕干重以估計肺組織的水腫程度。肺濕/干重比(mg/g)=(肺濕重-肺干重)/肺干重。

1.4 統計學方法 采用SPSS 12.0統計軟件包進行分析。所有數據以表示,組內比較采用t檢驗,組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 一般情況及生存率 Control組大鼠不進行放血及復蘇,Shock組放血量(7.51±0.82)mL,IL-10組大鼠放血量(7.86±0.63)mL,組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。24h后Control組大鼠沒有死亡,Shock組大鼠在復蘇后2h內死亡1只,5h死亡1只,24h死亡1只。IL-10組在休克復蘇后6h死亡1只,復蘇后24h死亡2只,與Shock組相比差異無統計學意義。

2.2 血清各項血氣指標 與Control組相比,Shock組PaO2和pH值均明顯降低,二氧化碳分壓(PaCO2)明顯升高,差異有統計學意義(P＜0.01);與Shock組相比 IL-10組PaO2和pH值升高,PaCO2降低,差異有統計學意義(P＜0.05);IL-10組與Control組相比,PaO2、PaCO2和pH 值差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.3 3個組大鼠肺通透指數(LPI)、肺濕/干重比值 與Control組相比,Shock組大鼠肺通透指數、肺濕/干重比顯著增大,差異有統計學意義(P＜0.01);與Shock組相比,IL-10組大鼠肺通透指數、肺濕/干重比值明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.01)(表 2)。

表1 3個組大鼠各項血氣指標的比較(n=8)

表1 3個組大鼠各項血氣指標的比較(n=8)

▲:與Control組比較,P＜0.01;★:與Shock組比較,P ＜0.01。

組別 PaO2(kPa)PaCO2kPa)PH Control組 13.70±0.67 4.28±0.55 7.41 ±0.05 Shock組 7.21±0.84▲ 6.29±0.62▲ 7.26±0.05▲IL-10組 12.84±0.73★ 4.47±0.51★ 7.38±0.04★

表2 3個組大鼠W/D比值、LPI和BA LF中性粒細胞比值(n=8)

表2 3個組大鼠W/D比值、LPI和BA LF中性粒細胞比值(n=8)

▲:與Control組比較,P＜0.01;★:與 Shock組比較,P＜0.01。

組別 W/D比值 LPI(10-3)BA LF中性粒細胞(%)Control組 4.65±0.15 5.12±0.36 15.6±4.3 Shock組 7.03±0.12▲ 13.61±0.54▲ 56.89±7.8▲IL-10組 5.17±0.22★ 5.81±0.42★ 27.1±5.6★

2.4 3個組大鼠支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞比值 結果見表2,與Control組相比,Shock組大鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞總數明顯增多,中性粒細胞計數比顯著增大,差異有統計學意義(P＜0.01);IL-10組與Shock組相比,大鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞總數、中性粒細胞計數比明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.5 3個組大鼠血清中SOD、M DA含量的比較 Shock組大鼠血清中MDA水平較Control組顯著增加,差異有統計學意義(P＜0.01),而IL-10組較Shock組則明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.01);RL組大鼠血清中SOD水平較Control組顯著下降,而IL-10組較Shock組則顯著增加,差異有統計學意義(P＜0.01),見表 3。

2.6 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液上清液及血清中IL-1、IL-6、TNF-α水平 Shock組大鼠支氣管肺泡灌洗液中 IL-1、IL-6、TNF-α水平較Control組顯著升高,差異有統計學意義(P＜0.01),而 IL-10組較RL組則明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.01),見表 4。

表3 3個組大鼠血清中SOD和M DA含量的比較(n=8)

表3 3個組大鼠血清中SOD和M DA含量的比較(n=8)

▲:與Control組比較,P＜0.01;★:與 Shock組比較,P＜0.01。

組別 MDA含量(nmol/mL)SOD含量(u/mL)Control組 3.75±0.62 85.17±9.41 Shock組 7.32±0.54▲ 36.28±7.37▲IL-10組 4.19±0.73★ 67.91±13.82★

表4 3組大鼠支氣管肺泡灌洗液上清液及血液中IL-1、IL-6、TNF-α水平pg/mL)

表4 3組大鼠支氣管肺泡灌洗液上清液及血液中IL-1、IL-6、TNF-α水平pg/mL)

▲:與Control組比較,P＜0.01;★:與 Shock組比較,P＜0.01。

IL-1IL-6TNF-α組別BALF 血清BALF 血清BA LF 血清Control組 30.5±16.8 152.6±63.4 42.7±14.5 85.8±13.4 58.1±34.9 265.8±103.7 Shock組 178.3±42.1▲ 461.7±193.6▲ 171.9±88.3▲ 424.6±182.9▲ 670.8±227.4▲ 1 869.6±732.8▲IL-10組 91.4±57.6★ 217.5±165.8★ 61.9±32.6★ 128.3±93.4★ 162.9±78.1★ 610.5±279.3★

3 討 論

失血性休克是創傷后患者死亡的主要原因之一。早期階段患者死亡主要是由于出血沒有得到控制,經歷休克和復蘇存活的患者往往會發生難以控制的系統性炎癥反應最終導致終末器官損傷甚至死亡,而急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征則是主要的死亡原因[8]。

在急性肺損傷發生的過程中,促炎性細胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和 TNF-α的大量釋放發揮關鍵的作用[1]。IL-10是一種免疫調節細胞因子,能夠減輕多種創傷刺激后過度的炎癥反應。IL-10通過抑制NF-κ B等途徑抑制促炎性細胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12 等的合 成[3,9-12],促進 中性 粒細胞 凋亡[13],從而減輕肺部的炎癥反應。同時IL-10缺陷的大鼠失血性休克后易于并發肺部損傷而肝臟損傷的概率并沒有增加[14],而外源性的IL-10應用也顯示能夠減輕傷害刺激誘發的免疫功能障礙[15]。

在傷害刺激后IL-10的釋放或者給予IL-10顯示良好的效應[16],在休克的早期應用 IL-10能夠減少 TNF-α的劇烈增加[6]。本研究結果證明在失血性休克起始階段給予外源性的重組白細胞介素10與單純復蘇相比在各項血氣指標方面得到了很大的改善,說明給與rhIL-10能夠改善肺泡的氧合。本研究結果顯示IL-10組大鼠肺濕/干重、肺通透指數與Shock組大鼠相比均有明顯的降低,IL-10組血清中 MDA含量低于Shock組,而SOD含量高于Shock組,說明 HSPTX復蘇失血性休克大鼠能夠降低肺毛細血管通透性。同時,結果顯示IL-10組大鼠BALF上清液及血液中 IL-1、IL-6、TNF-α水平較Shock組顯著降低,表明給予IL-10可以有效地減少促炎性細胞因子的釋放并減輕肺部的炎癥反應,盡管實驗結果與Karakozis等[6]并不完全一致。

值得注意的是,本實驗選擇的時間點是失血性休克復蘇后24h,在24h內雖然IL-10組的肺部炎癥反應得到了有效的控制,然而IL-10組與Shock組相比生存率差異無統計學意義。本研究沒有觀察遠期時間點肺部炎癥反應的變化和生存率的比較,因此,可能給予外源性的IL-10只是推遲炎癥反應而沒有阻止炎癥反應。IL-10的過量釋放本身會導致機體免疫機能的低下,增加感染的可能性,尤其是在膿毒血癥的患者是非常有害的[16]。在無菌性炎癥中,IL-10能夠發揮良好的抗炎效應,但是也有可能抑制機體的免疫功能,增加機體后期致命性感染的發生,因此,臨床上應用IL-10還需要進一步的驗證。

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