艙內腹部閉合性爆炸傷大鼠血漿內毒素的變化及意義

聶 海,賴西南,黃顯凱,王麗麗

(第三軍醫大學大坪醫院:1.野戰外科研究所創傷、燒傷和復合傷國家重點實驗室第六研究室;2.醫院全軍戰創傷中心,重慶400042)

現代戰爭爆炸性武器的大量使用和平時意外突發性爆炸事件的頻繁發生[1],導致爆炸性損傷有增多趨勢[2],而爆炸事件大部分發生在相對密閉空間如戰斗艙室、汽車、地鐵、煤窯等,其物理性質與開闊地爆炸不盡相同。在爆炸性損傷中,腹部爆炸傷發生率較高[2]。研究表明,相對密閉空間腹部爆炸傷較開闊地爆炸傷情更嚴重[3],腸道氧化應激反應更劇烈[4]。爆炸傷可引起腸道缺血缺氧、氧化應激反應增強,但是否可導致內毒素移位尚不清楚。本研究試圖通過艙室模擬器內爆炸建立致傷模型,觀察艙內大鼠腹部爆炸傷后血漿內毒素的動態變化,為早期診斷腸源性感染和相對密閉空間爆炸傷員的合理救治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 復制動物模型及采集標本 100只230g左右健康雄性SD大鼠隨機分為艙內組、艙外組,每組50只。速眠新Ⅱ(長春軍需大學獸醫研究所提供)0.4mL/kg體重進行股部肌肉注射麻醉。將大鼠固定于艙室,用600mg DDNP紙質點爆源懸掛于陸軍模擬戰斗艙室(第三軍醫大學野戰外科研究所研制)中央,爆心距離大鼠腹部中央10cm引爆,爆炸后立即將大鼠取出艙室。爆炸后觀察大鼠胸、腹壁有無穿透傷、貫通傷、盲管傷,如有開放性損傷則剔除,致傷后3、8、24、48h和 72h處死大鼠按要求采集門靜脈血和腹主動脈血標本,另采集10只未致傷的正常大鼠血標本。

表1 外周血內毒素水平變化情況(Eu/mL

表1 外周血內毒素水平變化情況(Eu/mL

與致傷前比較,*:P＜0.05,#:P＜0.01;與艙外組比較,△:P＜0.05,▲:P＜0.01。

傷后時間(h)組別 傷前3 8 24 48 72艙內組 0.077±0.019 0.267±0.052# 0.424±0.084#△ 0.553±0.065#▲ 0.602±0.182#▲ 0.598±0.198#▲艙外組 0.077±0.019 0.208±0.067* 0.332±0.080# 0.381±0.129# 0.344±0.093# 0.270±0.119#

表2 門靜脈血內毒素水平變化情況(Eu/mL

表2 門靜脈血內毒素水平變化情況(Eu/mL

與致傷前比較,*:P＜0.05,#:P＜0.01;與艙外組比較,△:P＜0.05,▲:P＜0.01。

傷后時間(h)組別 傷前3 8 24 48 72艙內組 0.077±0.011 0.527±0.151#△ 0.648±0.152#▲ 0.782±0.152#▲ 0.865±0.130#▲ 0.706±0.159#▲艙外組 0.077±0.011 0.380±0.095# 0.474±0.098# 0.580±0.160# 0.570±0.100# 0.483±0.087#

1.2 檢測內毒素 采用改良基質顯色鱟試劑[5]法檢測血漿內毒素水平(上海伊華臨床醫學科技公司),根據內毒素標準曲線(圖1)求得內毒素含量。

1.3 檢測血IL-6和TNF-α水平 采用雙抗體夾心ELISA法檢測OD值,根據不同濃度標準品制定的標準曲線,求得血漿IL-6[6]和 TNF-α濃度[7],實驗步驟按照試劑盒(晶美生物工程有限公司)說明書進行。

2 結 果

2.1 外周血內毒素水平變化 大鼠腹部爆炸傷后血漿內毒素水平在3h開始升高,與傷前比較差異有統計學意義(P＜0.05);艙內組 48h達高峰,艙外組 24h達峰值;艙內組血漿內毒素水平較艙外組升高快,且持續時間長,傷后8h艙內組明顯高于艙外組,組間比較差異有統計學意義(P＜0.05),致傷后72h仍明顯高于艙外組,見表1。總體來說,艙內組與艙外組比較內毒素水平明顯上升(t=4.153,P＜0.001)。

2.2 門靜脈血內毒素水平變化 大鼠腹部爆炸傷后血漿內毒素水平在3h開始升高,與傷前比較差異有統計學意義(P＜0.05);艙內組 48h達高峰,艙外組 24h達峰值;艙內組血漿內毒素水平較艙外組升高快,且持續時間長,傷后8h艙內組明顯高于艙外組,組間比較差異有統計學意義(P＜0.05),到傷后72h仍明顯高于艙外組,見表2。艙內組門靜脈血內毒素水平較艙外組明顯升高(t=4.818,P＜0.001)。

2.3 外周血和門靜脈血內毒素水平比較 相同時間點門靜脈血和外周血內毒素水平比較發現,門靜脈血內毒素水平較外周血升高快且明顯,但24h后組間比較差異無統計學意義,見表3。

表3 同一時間點外周血和門靜脈血內毒素水平比較

2.4 外周血TNF-α水平變化 艙內組大鼠腹部爆炸傷后血漿TNF-α水平在傷后3h內即開始快速升高,且明顯高于艙外組,與傷前、艙外組比較差異具有統計學意義(P＜0.05);艙內組48h、艙外組24h達峰值;艙內組血漿內毒素水平較艙外組升高快,且持續時間長,傷后72h仍明顯高于艙外組,見表4。總體來說,艙內組與艙外組比較差異有統計學意義(t=4.492,P＜0.001)。

2.5 外周血IL-6水平變化 艙內組大鼠腹部爆炸傷后血漿IL-6水平在傷后8h內開始升高,明顯高于艙外組,組間比較差異有統計學意義(P＜0.05);艙內組48h、艙外組24h達高峰;艙內組血漿IL-6水平較艙外組升高快,且持續時間長,傷后72h仍明顯高于艙外組,見表5。總體來說,艙內組與艙外組比較差異有統計學意義(t=2.513,P=0.013)。

表4 外周血血漿 TNF-α水平變化(ng/mL

表4 外周血血漿 TNF-α水平變化(ng/mL

與致傷前比較,*:P＜0.05,#:P＜0.01;與艙外組比較,△:P＜0.05,▲:P＜0.01。

傷后時間(h)組別 傷前3 8 24 48 72艙內組 0.58±0.06 1.03±0.09#△ 1.67±0.21#△ 2.67±0.26#△ 2.80±0.35#▲ 2.41±0.22▲艙外組 0.58±0.06 0.78±0.11 1.39±0.22# 2.14±0.51# 2.14±0.47# 1.78±0.32#

表5 外周血血漿IL-6水平變化(pg/mL

表5 外周血血漿IL-6水平變化(pg/mL

與致傷前比較,*:P＜0.05,#:P＜0.01;與艙外組比較,△:P＜0.05,▲:P＜0.01。

傷后時間(h)組別 傷前3 8 24 48 72艙內組 96.4±16.8 126.9±20.6 275.4±40.3#△ 323.3±32.6#▲ 265.5±33.8#▲ 216.6±27.8#▲艙外組 96.4±16.8 118.2±18.8 228.8±20.8# 238.0±30.2# 162.0±17.7# 137.7±20.5#

圖1 內毒素標準曲線圖

2.6 門靜脈血內毒素水平與外周血內毒素、IL-6、TNF-α水平的相關性 相關分析表明,門靜脈血內毒素水平與外周血漿內毒素、IL-6、TNF-α呈正相關,見表 6。

表6 門靜脈血內毒素水平與外周血漿指標的關系

3 討 論

正常大鼠由于腸道屏障功能的作用,血液循環中僅含有極微量的內毒素,但不會對機體造成危害,因為生理情況下,即使有少量內毒素入血,由于肝臟的強大解毒屏障功能,內毒素也很容易被體內防御系統清除。本研究結果顯示,不管是門靜脈血還是外周血內毒素水平艙內組均明顯高于艙外組,而且水平更高、持續時間更長,表明艙內組的腸源性內毒素血癥發生早且持續更久,相對密閉空間爆炸傷員機體發生腸源性內毒素血癥的可能性大;此外,門靜脈血內毒素水平與外周血變化趨勢基本一致,提示在大鼠腹部爆炸傷后檢測外周血內毒素水平可以近似反映腸道內毒素移位。外周血血漿 TNF-α和IL-6水平變化趨勢與內毒素水平變化基本一致,提示通過檢測外周血TNF-α和IL-6水平間接判斷是否存在腸道內毒素移位,艙內組腹部爆炸傷后全身炎癥反應較艙外組重,且持續時間長,可能更易發生全身炎癥反應綜合征,進而導致多器官功能衰竭(MODS)。但 TNF-α水平較 IL-6升高早、上升速度快,而且維持在較高水平,這種差異可能反映了這些細胞因子在全身炎癥反應中所起不同的作用:TNF-α是早期表達的致炎介質,它誘導IL-6產生與IL-6在體內產生免疫協同作用;而IL-6后續產生對炎癥進一步發展起促進作用。

本研究還發現,在相同時間點外周血內毒素水平較門靜脈血低,表明腸道內毒素通過腸黏膜屏障進入門靜脈血,通過肝臟的解毒、過濾功能,降低門靜脈血內毒素水平,進入外周血的內毒素減少,導致外周血內毒素水平較門靜脈血低;而傷后48h后門靜脈血內毒素水平和外周血比較差異無統計學意義,可能是由于肝臟已經發揮最大的清除內毒素潛能,導致二者水平相近,也可能是由于大鼠腸道功能開始恢復,腸黏膜上皮功能改善,腸道通透性降低,內毒素吸收減少,而外周血中仍有殘余內毒素,導致二者無明顯差異。

因此作者認為,大鼠在腹部爆炸時一方面由于沖擊波的直接作用導致腸道受損,腸黏膜上皮細胞發生缺血、缺氧,腸道發生氧化應激反應[4],導致腸黏膜通透性增加,內毒素容易逸出腸壁進入血液循環;此外,爆炸傷時也可發生細菌移位(另文報道),細菌在血循環中發生死亡、降解也可以釋放大量內毒素,使血中內毒素水平進一步升高,形成內毒素血癥。當血中細菌內毒素持續升高時,一方面通過直接激活單核-巨噬細胞系統及中性粒細胞,誘導其分泌多種介質如TNF-α、IL-1和 IL-6等[8],通過這些介質在局部或循環中播散至機體其他部分而發揮效應作用。另一方面內毒素與內毒素結合蛋白(LBP)結合后,可明顯增加巨噬細胞對細菌吞噬以及促進TNF-α分泌[9]。TNF-α是炎癥介質網絡的關鍵因子,主要參與宿主對膿毒血癥、創傷和MODS的反應。促進TNF-α產生的病原有許多,其中內毒素最引人注意,它能同時激活TNF的轉錄和翻譯,并促進巨噬細胞分泌TNF-α。當細菌或病毒進入機體后TNF-α在循環中出現較早并迅速達到高峰,它可誘導內皮細胞和巨噬細胞釋放IL-6,而IL-6隨后又刺激其他細胞因子的生物合成,并反過來增強組織細胞對TNF-α的敏感性,參與或調節機體的炎癥反應和免疫反應,可作為反映機體炎癥與疾病嚴重程度的重要指標。

綜上所述,腹部爆炸傷后沖擊波作用導致腸黏膜缺血缺氧、發生氧化應激反應,增加腸黏膜通透性,促進大量內毒素移位,發生內毒素血癥,然后激活炎癥細胞產生炎癥介質,炎癥介質又放大內毒素的作用,導致體內免疫異常,直接或間接地引起或加重器官功能損害,甚至引起死亡,因此內毒素和炎癥介質在腹部爆炸傷后判斷病情嚴重程度和繼發器官功能受損中起著重要的作用,因此了解內毒素和炎癥介質的致病機制及其作用特點,對臨床上選擇有效防治MODS的方法具有重要的意義[10-11];在臨床上測定腹部爆炸傷傷員血漿內毒素水平和炎癥介質,既可以準確判斷傷情,盡早判斷預后,又可以判斷藥物干預的效果,適時調整治療方案,對促進合理用藥和提高患者預后及生活質量有重要意義。

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