膀胱出口部分梗阻大鼠逼尿肌中糖原變化及其意義

李海洋,王道英,鐘甘平,王志平,史庭愷,馬俊林

(1.甘肅省人民醫院泌尿外科,蘭州730000;2.甘肅武威腫瘤醫院放療科,甘肅武威733000;3.蘭州大學第二醫院泌尿外科,蘭州730030)

本實驗觀察大鼠膀胱出口部分梗阻(partial bladder outlet obstruction,PBOO)后逼尿肌中糖原變化,探討其與膀胱功能變化的關系,以期為預測和監測膀胱功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組 健康雌性Wistar大鼠70只(清潔級,2～3個月齡,180～250g,購自蘭州軍區總醫院動物實驗中心),根據預實驗結果將大鼠分為實驗組(44只)和對照組(18只),同時按得分情況分為 0、1、2、3分組。每周有一批做尿動力功能測定后切除膀胱進行組織分析(表1),有8只大鼠在飼養中途死亡。

1.2 PBOO模型建立和膀胱造瘺 用石洪波法建立PBOO動物模型[1],術后3d每天各大鼠給青霉素40萬單位腹腔注射,以后連續3d飲水中加入環丙沙星膠囊,濃度為1‰;用周德榮法于每周尿動力測定前行大鼠膀胱造瘺[2]。

1.3 膀胱功能測定 水合氯醛腹腔麻醉后,剪開皮膚縫合線結,經造瘺管行充盈性膀胱測壓,導管經三通管與尿動力儀和灌注泵連接,輕壓膀胱排空尿液,室溫下以0.2mL/min的流速從導管灌注生理鹽水,記錄最大膀胱壓力(cm H2O)、最大膀胱容量(mL),計算漏尿點時的膀胱順應性(△mL/△cm H2O)。

1.4 PAS染色及組織分析 尿動力學測定后留取膀胱,天平稱重,標本用Carney′s液固定2h后做組織切片;PAS染色后,由4個實驗員(盲法)對糖原含量與分布情況進行評分,評分標準:0分組即沒有糖原;1分組糖原出現在近漿膜的逼尿肌層內;2分組糖原出現在肌層深處;3分組糖原在逼尿肌全層可見,糖原顆粒在靠近固有層處也可見。要求實驗員內部對于一個樣本的差異都小于1分。

1.5 統計學方法 應用SPSS15.0統計學軟件分析,結果用5%、25%、75%、95%百分位數值表示,并采用 Box-Whisker Plots圖分析,用Mann-Whitney U檢驗來檢驗糖原評分差異有無統計學意義,P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 實驗組和對照組每周處死的大鼠數

2 結 果

2.1 實驗組和對照組大鼠在不同糖原評分中的數量分布情況見表2。表2顯示,對照組中有45.44%的標本為 0分,實驗組有43%為1分,而總的來說有40%為1分。兩組分布差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 PAS染色結果 糖原顆粒出現在肌細胞細胞質中,呈紫紅色。本實驗發現,隨著糖原含量的增加,糖原沉積的位置也從肌層近漿膜處向黏膜固有層延伸(圖1)。

圖1 不同糖原評分的膀胱組織切片PAS染色(×200)

2.3 糖原變化和尿動力參數的關系(Box-Whisker Plots圖)圖2a、b示:PBOO時間、膀胱濕重和糖原評分呈正相關,2、3組數據分布較寬。圖2c、d、e示:2分組和3分組的膀胱最大壓力、容量和膀胱順應性與0分、1分組相比差異有統計學意義(P＜0.05),3分組和 2分組的差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 實驗組和對照組在不同糖原評分組中的數量分布情況〔n(%)〕

圖2 糖原評分和尿動力參數關系的Box-Whisker Plots圖

3 討 論

本實驗建立PBOO動物模型,從分析膀胱組織和功能入手,著眼于膀胱逼尿肌中糖原的變化,并采用PAS染色來檢測膀胱逼尿肌細胞中的糖原,研究PBOO后膀胱功能的變化發展。這種模型的優點在于可以每周進行尿動力學分析,而且很容易獲得膀胱活組織,并描繪膀胱功能變化的時間過程:從功能正常到過度收縮和沒有順應性,或者甚至沒有收縮性。還可以完全了解每只大鼠膀胱的尿動力學變化過程。

本研究發現,膀胱中糖原沉積的程度和位置與獲得組織標本時尿動力功能有關。糖原評分的增加與膀胱功能障礙的嚴重性有關,又與梗阻的期限有關;同時顯示,糖原評分和PBOO時間呈正相關,但是數據分布寬窄不同,2分組數據分布最寬,這表明此時間段內梗阻造成的糖原變化最明顯,但不是膀胱功能變化最明顯。雖然在膀胱壓力、膀胱容量和順應性方面不好比較,但可通過反應非常不同的糖原評分來區分,本實驗結果顯示糖原評分超過1分,就說明膀胱功能開始惡化。Levin等[3]認為代償期進入失代償期沒有明確的時間標準,但本實驗結果提示,評分為1分可以大概區分代償期和失代償期,這個結果提示,如果對處于糖原評分為1分的膀胱進行及時的治療,理論上效果是非常滿意的。實驗結果中膀胱壓力、膀胱容量和順應性方面3分組和2分組間差異沒有統計學意義說明膀胱功能已經惡化,但是繼續惡化不明顯,原因可能是手術造模時梗阻較輕,或者是樣本量太小所致。本實驗的一個局限性在于對糖原的評分方法過于主觀,尚有待于進一步改進。值得提出的是本實驗中順應性的變化出現一個先增加的過程,可能是由于膀胱容量增加所致。

最近研究表明,糖原的沉積和逼尿肌對膀胱內高壓引起的組織缺血產生的適應有關,受累的肌細胞被迫在缺氧的情況下工作,此時代償功能增強,糖原大量產生并沉積下來作為儲備[4-7]。Pessina等[8]報道,人、猴子、豚鼠的離體膀胱逼尿肌條在一段時間的缺氧后糖原含量會下降,這和體內整個器官的糖原儲存的表現是矛盾的,體內實驗發現發生缺血的時間越長,糖原顆粒就越多。本實驗關于體內膀胱的研究結果表明PBOO后一段時間逼尿肌細胞糖原是增多的,而且還重點觀察了糖原顆粒的分布情況,但是上述研究方法學上和本實驗不同,故本結果還無法與文獻進行比較。

目前國內外臨床上診斷PBOO主要通過尿動力學檢查。Franco等[9]認為,診斷和評估膀胱出口梗阻(BOO)尿動力學檢查結果最準確,但是尿動力檢查可重復性及穩定性差,不能準確評價膀胱功能。徐濤等[10]的研究結果顯示,應用充盈性膀胱測壓檢查前列腺增生癥(BPH)伴BOO患者獲得的參數結果中,只有最大尿流率時逼尿肌壓力(PdetQmax)不論在同一次檢查還是在間隔較長時間的再重復檢查都具有較優的重測信度。這說明盡管選擇的參數很多,但是可供選擇的準確參數并不多。通過研究,作者認為糖原沉積還沒有超過近漿膜的逼尿肌層時膀胱功能恢復的潛力較大,所以本實驗結果有可能成為評價膀胱功能的一個重要參數。但是de Jong等[11]關于雄性豚鼠PBOO模型中逼尿肌中糖原的研究結果認為逼尿肌靠近固有膜處有糖原沉積意味著膀胱功能恢復的潛力小,與本實驗結果有出入,有可能是動物種屬差異和(或)造模引起的梗阻程度不同所致。

本實驗關于PBOO后逼尿肌中糖原變化的研究結果基于膀胱標本的獲取,而且僅限于動物實驗,臨床應用要獲取膀胱標本是不現實的,但是結合當前快速發展的拉曼分光鏡檢術及其在組織分析中的應用,作者有可能利用此項技術避免臨床上活組織檢查就能獲得數據,這些數據可能在很大程度上用于幫助膀胱功能分析的應用,為評價外科手術和藥物治療PBOO效果以及預測、監測膀胱功能提供重要依據。

[1]石洪波,孫曉松,余志遠,等.膀胱出口梗阻大鼠逼尿肌中神經生長因子mRNA的變化及意義[J].中華實驗外科雜志,2007,24:331.

[2]周德榮,章振保.大鼠膀胱出口梗阻模型的建立及其尿動力學檢測[J].汕頭大學醫學院學報,2004,17:165.

[3]Levin RM,Levin SS,Zhao Y,et al.Cellular and molecular aspects of bladder hypertrophy[J].Eur Urol,1997,32(Supp 11):15.

[4]Greenland JE,Hvistendahl JJ,Andersen H,et al.The effect of bladder outlet obstruction on tissue oxygen tension and blood flow in the pig bladder[J].BJU Int,2000,85:1109.

[5]Azadzoi KM,Tarcan T,Kozlowski R,et al.Overactivity and structural changes in the chronically ischemic bladder[J].J Urol,1999,162:1768.

[6]Brading A,Pessina F,Esposito L,et al.Effects of metabolic stress and ischaemia on the bladder,and the relationship with bladder overactivity[J].Scand J Urol Nephrol Suppl,2004,215:84.

[7]Gosling JA,Kung LS,Dixon JS,et al.Correlation between the structure and function of the rabbit urinary bladder following partial outlet obstruction[J].J Urol,2000,163:1349.

[8]Pessina F,Solito R,Maestrini D,et al.Effect of anoxiaglucopenia and re-superfusion on intrinsic nerves of mammalian detrusor smooth muscle:importance of glucose metabolism[J].Neurourol Urodyn,2005,24:389.

[9]Franco G,De Nunzio C,Minardi V,et al.Patients with bladder outlet obstruction who refuse treatment show no clinical and urodynamic change after long-term follow-up[J].Arch Ital Urol Androl,2004,76:6.

[10]徐濤,張小東,王曉峰,等.膀胱出口梗阻患者充盈性膀胱測壓參數的重測信度評價[J].中華泌尿外科雜志,2006,27:304.

[11]de Jong BW,Wolffenbuttel KP,Arentshorst ME,et al.Detrusor glycogen reflects the functional history of bladders with partial outlet obstruction[J].BJU Int,2007,100(4):846.