P16INK4A、Ki-67和HPV DNA16/18在絕經后婦女宮頸鱗狀上皮病變中表達的意義

胡俊波,孫 軍

(湖北省婦幼保健院病理科,武漢430070)

2008年底,我國60歲以上老年人口已達到1億5989萬人,占總人口的12%,表明已經進入了老齡化社會,老年人的健康日益引起社會的廣泛關注。宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤,和高危HPV感染密切相關[1-2]。老年宮頸癌預后差,病死率高,嚴重威脅老年婦女身心健康。陰道鏡活檢做病理檢查作為診斷宮頸病變的金標準,降低了宮頸癌的發病率。絕經后婦女因雌激素水平降低常常導致宮頸上皮萎縮,細胞層次減少,部分區核深染,與高級別上皮內瘤變易混淆,成為診斷的陷阱[3-5]。本研究對104例絕經后患者宮頸組織進行總結,以期找出有效的診斷標準。

1 材料與方法

1.1 材料 取自湖北省婦幼保健院病理科2004年12月至2008年12月子宮頸活檢及手術切除標本的存檔蠟塊共104例。其中CINⅠ級43例、CIN Ⅱ～Ⅲ級19例、宮頸浸潤癌22例,20例萎縮的宮頸組織為對照組。腫瘤分型按WHO(2003)女性生殖系統腫瘤分類標準進行。本組104例患者年齡55～75歲,平均(58.37±4.82)歲。

1.2 方法 用原位雜交法(ISH)檢測 HPV DNA16/18;用免疫組化Envision法檢測P16INK4A、Ki-67抗原。地高辛標記的HPV 16/18原位雜交探針、放大系統檢測試劑盒(福州泰普公司產品),單克隆抗體P16INK4A及多克隆抗體 Ki-67均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。HPV檢測陽性對照用子宮頸癌陽性片加陽性探針,TBS液代替陽性探針作為陰性對照。Envision檢測用TBS代替一抗作為陰性對照,乳腺癌組織作陽性對照。

結果判斷:在高倍鏡下隨機選取3個視野,每個視野計數200個腫瘤細胞或鱗狀細胞。HPV原位雜交:以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性。P16INK4A蛋白定位細胞核或細胞質內出現有棕黃色顆粒。按其染色有無及強弱程度劃分為:陽性細胞數小于5%或無陽性細胞為陰性;6%～25%為弱陽性;26%～50%為陽性;大于50%為強陽性。Ki-67以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性,僅基底層細胞有表達為(-);陽性細胞數1%～20%為(+);21%～50%為(++);大于50%為(+++)。

1.3 統計學方法 處理采用SAS 8.12軟件分析,計數資料比較使用χ2檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HPV與宮頸病變的關系(表1) HPV16/18在宮頸鱗癌、CIN組中均有陽性表達,在萎縮對照組中無表達(圖1)。HPVl6/18型在宮頸鱗癌及CIN組中的表達水平與萎縮對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05),并且隨著CIN組織學分級的增加呈升高趨勢,尤其在宮頸CINⅡ/Ⅲ級、鱗癌兩組中的表達最明顯(圖2)。本實驗宮頸病變中 HPV總檢出率為28.57%(24/84)。

2.2 P16INK4A、Ki-67與宮頸病變的關系 P16INK4A、Ki-67在宮頸鱗癌、CINⅢ/Ⅱ、Ⅰ組的陽性表達率與萎縮對照組比較差異差異有統計學意義(P＜0.05)。隨著宮頸病變嚴重程度的增加,P16INK4A、Ki-67的陽性表達率呈增加趨勢,尤其在宮頸鱗癌和CIN中的陽性表達率明顯增高(表2)。P16INK4A在宮頸鱗癌、CINⅢ、CINⅡ組中,表達以胞核和胞漿強陽性為主(圖3);在CINⅠ組中僅為弱陽性表達。Ki-67在宮頸鱗癌和CINⅢ中以強陽性表達為主(圖4)。P16INK4A、Ki-67在萎縮對照組中呈陰性表達(圖5、6)。

表1 HPV DNA 16/18在不同程度宮頸病變中的表達

表2 P16INK4A、Ki-67在不同程度宮頸病變中的表達

圖1 萎縮性黏膜細胞核HPVl6/18不表達(-)ISH法

圖2 CINⅢ中,中、表層細胞核出現散在棕黃色顆粒的細胞為HPVl6/18(+)ISH法

2.3 HPV DNA 16/18感染與P16INK4A表達程度之間的比較見表3。在絕經后婦女子宮頸萎縮病變中,HPV DNA 16/18感染與P16INK4A蛋白表達為陰性,隨著CIN組中HPV DNA 16/18陽性率愈高,P16INK4A蛋白表達的強度就愈強。

圖3 CINⅢ中,P16INK4A在細胞核及細胞漿中出現彌漫棕黃色顆粒(+)SP法

圖4 Ki-67全層細胞核表達呈棕黃色顆粒(+)SP法

圖5 萎縮性黏膜細胞漿及細胞核P16INK4A不表達(-)SP法

圖6 萎縮性黏膜基底及旁基底層細胞核Ki-67呈散在棕黃色顆粒(-)SP法

表3 HPV DNA 16/18的感染與P16INK4A的關系

3 討 論

HPV感染是宮頸癌及癌前病變形成的最重要的原因,特別是持續性高危型HPV l6/18感染,如HPVl6型可在差不多50%的宮頸高度上皮鱗狀上皮內瘤變(HSIL)和鱗癌中發現,HPV18型與15%的鱗癌有關。老年患者的HPV病毒負荷量是較高的,研究發現,HPV感染在人群中呈U型或S型分布,第1個高峰在25～35歲,第 2個高峰在大于55歲年齡段[6-8]。大多數HR-HPV感染(大于 55歲)與 HSIL及鱗癌密切相關,其中HPV 16/18是最常見的病毒亞型。當HPV16/18感染宮頸時,可將 HPV DNA整合到宿主細胞基因組中,進而病毒DNA上的E6、E7癌基因表達蛋白能引起自身調節和宿主調節基因表達失調,從而影響正常細胞周期調控,導致宮頸上皮細胞發生惡變。本研究結果顯示:HPV 16/18 DNA在19例CINⅡ/Ⅲ級和 22例宮頸癌組織中的陽性表達率分別為47.3%、36.4%,與文獻[9]報道近似。子宮頸 CINⅡ/Ⅲ級和鱗癌組 HPV16/18DNA陽性表達率明顯高于萎縮組(P＜0.01),且高于CINⅠ級組,證實子宮頸鱗狀細胞癌發生與高危型HPV 16/18感染密切相關。萎縮組表達陰性,表明HPVl6/18 DNA在易誤診為HSIL的萎縮病變時可作為有效的鑒別診斷工具。本研究結果還顯示,原位雜交技術是一種檢測HPV感染的特異性強、技術成熟的方法,特異性可能比基于液體的方法強,定位準確,陽性預測值高,可直接發現整合到宿主細胞內的HPV核酸[2]。而免疫組化檢測HPV不敏感,檢出率低;美國Digene公司 HC2檢測 HPV是非特異性(部分陽性病例是正常人群,可能為一過性病毒感染)[10]。結果提示原位雜交可作為臨床HPV檢測有效手段。

HPV與細胞周期的變化有關,特別是高危險性的HPV,所以細胞周期生物標志物能夠起HPV感染的替代標志物的作用,而且可以用于促進宮頸前體病變的精確診斷。P16INK4A是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑,在宮頸鱗狀上皮非腫瘤性病變中陽性率極低或全部陰性,而在CIN尤其在高級別CIN中陽性率極高,作為輔助的診斷標記物可以有效地區分出CIN病變[11-12]。本研究的結果顯示P16INK4A蛋白在老年患者正常或萎縮性宮頸鱗狀上皮中均為陰性表達,而在CIN病變中陽性率顯著增加,隨著CIN級別升高,其表達強度亦相應增加,在CINⅡ/Ⅲ級和鱗癌組陽性率達 100%,與 Qiao等[13]報道相一致。據此可使絕大部分CIN病變區分出來,并客觀準確的分級。隨著CIN組中HPV DNA 16/18陽性率愈高,P16INK4A蛋白表達的強度就愈強,表明P16INK4A蛋白具有高危HPV的強烈陽性預測值。本研究結果顯示Ki-67在萎縮性宮頸鱗狀上皮標本中局限于基底及旁基底層,數量較少且散在,為陰性;在低級別鱗狀上皮內瘤變中陽性表達可達中層而高級別病變則可達全層;隨著病變級別增加,陽性表達也相應增高,可有助于區分萎縮與HSIL。但炎性及修復性病變中Ki-67表達也高,需聯合作P16INK4A蛋白(表達陰性),將假陽性病變排除。

綜上所述,在絕經后宮頸鱗狀上皮瘤變中免疫組化檢測P16INK4A蛋白和Ki-67抗原,原位雜交檢查高危型HPV感染,作為一種臨床病理有效輔助診斷工具,可明確地區分萎縮和CIN病變,并指導CIN分級,有較好的臨床應用價值。

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