腫瘤壞死因子-α對人喉鱗癌細胞放療增敏作用的實驗研究*

朱圣明,宋仕茂,吳 峰,駱志國,丁 珺,吳俊波

(湖北省十堰市鄖陽醫學院附屬太和醫院腫瘤科,湖北十堰442000)

放療在頭頸部惡性腫瘤,如喉癌的治療中占有重要的地位。然而,放療后腫瘤局部殘存和復發是放療失敗的主要表現形式,其根本原因在于腫瘤細胞中存在放射抗拒性細胞。單純從改進放射物理技術的角度來解決這一問題已經接近平臺期。因此,積極尋求聯合增敏的策略和手段是提高放療療效的重要途徑。為此,國內外學者開始嘗試著通過各種手段來增強腫瘤細胞對放療的敏感性,其中包括小劑量化療的放療增敏、分子靶向藥物的放療增敏、基因增敏以及中草藥的放療增敏等[1]。這些策略各異的增敏手段一定程度上增加了腫瘤細胞的放射敏感性,但也存在毒副反應大、療效有限的不足。

近年來,利用人體中正常存在的細胞因子等生物制劑用于放療增敏逐漸引起腫瘤研究者的關注[2]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是由激活的巨噬細胞或單核細胞分泌的一種具有多種生物活性的細胞因子。大量的研究證實,TNF-α除具有抗感染和調節機體免疫的功能外,尚可起到諸如腫瘤生長抑制等多種機制的抗腫瘤效應[3]。本研究建立人喉鱗癌放射抗拒性細胞模型Hep-2R,通過檢測 TNF-α對Hep-2R增殖、凋亡的影響及細胞凋亡相關基因表達水平的變化,探討TNF-α對放射抗拒性Hep-2R細胞放射敏感性的逆轉作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系 放射抗拒性人喉鱗癌細胞系Hep-2R為武漢大學中南醫院腫瘤研究所惠贈并于本研究室保存,細胞用完全培養基于37℃、5%CO2的孵箱中培養。該細胞系是在母本細胞Hep-2的基礎上經超分割照射誘導構建而成,并在傳代培養過程中經過多次放射敏感性檢測證實了其放射抗拒性[4]。

1.2 主要試劑和儀器 四甲基偶氮唑藍(MT T)購于武漢天源生物技術有限公司,為Duchefa分裝;TUNEL凋亡試劑盒為Roche公司產品;總RNA提取試劑盒為美國Invitrogen公司產品;M-MLV逆轉錄酶為美國Promega公司產品;Ex Taq DNA聚合酶為日本Takara公司產品;重組人腫瘤壞死因子α(rhTNF-α)為北京寶賽生物公司產品;流式凋亡檢測試劑盒為北京瑞幫興業科技有限公司產品;Elite ESP型流式細胞儀為美國Coulter公司生產;IX-71型倒置熒光顯微鏡為日本O-lympus公司生產。

1.3 M TT檢測 將貼壁細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后計數,調整細胞濃度為1×104/mL,接種于 96孔板。待12h細胞貼壁后加重組人TNF-α,實驗組分別加入終濃度為 100u/mL、200u/mL 、400u/mL 、600u/mL 的 TNF-α100μ L,對照 組(0u/mL)加入等體積溶劑的培養液,每組12復孔。MT T比色法分別于加藥后24、48、72h測定各孔570nm的吸光度值(OD值)。根據下列公式計算各培養孔中的細胞生長抑制率:細胞抑制率=(OD對照-OD實驗)/OD對照×100%。

1.4 T UNEL及流式細胞法檢測細胞凋亡 消化貼壁培養至對數生長期的Hep-2R細胞并計數,調整細胞濃度為2×105/mL。將干凈無菌玻片置入 6孔培養板中,按2×105/孔接種細胞。待各孔細胞鋪滿玻片80%,將細胞分組進行實驗?？瞻捉M:未作任何處理的Hep-2R細胞;TNF-α處理組:400u/mL TNF-α處理;TNF-α聯合放療處理組:400u/mLTNF-α處理后24h加用常規分割單次照射劑量2Gy(60Co治療機,射野20cm×20cm,源皮距80cm,61.3cGy/min),每組設置3個平行復孔;另設陰性對照組:地塞米松處理和陽性對照組:DNAase處理。處理后的細胞按照TUNEL凋亡檢測試劑盒操作方法進行凋亡檢測。發生凋亡的細胞DNA出現斷裂,其dUTP可被親和素標記的異硫氨酸熒光素(FITC-Sigma)標記,在熒光顯微鏡下呈熒光陽性,計算細胞平均凋亡率。另取上述處理細胞各1×106個用冷 PBS洗滌2次后重懸于200μ LBinding Buffer。再加入 10μ L Annexin V-FITC 和 10μ L PI,輕輕混勻,避光4℃反應30min。 最后加入 300μ LBinding Buffer,用于流式細胞術檢測細胞凋亡上機檢測。

1.5 Bax凋亡基因檢測 按照T rizol總RNA提取操作方法,提取上述各分組處理的細胞的總RNA。以等量的總RNA做為模板,逆轉錄合成第1條鏈。逆轉錄后的cDNA模板用以進行上述處理細胞中Bax mRNA的半定量檢測。引物的設計:根據GenBank中人 Baxα的序列(NM_138761)及內對照(人 β-actin)的序 列設計引物。 F1:5′-GCAAACTGGTGCTCAAGGC-3′;R1:5′-AGAAACACCGCCCTCACG-3′(擴 增189bp 的 Baxα片 段);F2:5′-GACTACCTCATGAAGATC-3′,R2:5′-GATCCACATCTGCTGGAA-3′(擴增 500bp 的人β-actin片段)。PCR反應條件:94℃預變性 2min,94℃30s,50℃30s,72℃2min,33個循環,最后72°后延伸 10min。等量PCR產物用15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條帶經Bandscan軟件灰度掃描后,灰度值進行統計學分析(SPSS13.0)。

1.6 克隆形成實驗 消化貼壁培養至對數生長期的Hep-2R細胞并計數。分別按200個/瓶和 400個/瓶在30cm2培養瓶中接種細胞作為空白對照和實驗組細胞。將貼壁生長的細胞分組進行實驗?？瞻捉M:未作任何處理的Hep-2R細胞;TNF-α處理組:400u/mL TNF-α處理;單純放療組:照射劑量 2Gy;TNF-α聯合放療處理組:400u/mLTNF-α處理后24h加用2Gy放療,每組設置3個平行對照,37℃,5%CO2細胞培養箱中連續培養2周。培養期結束,80%乙醇固定細胞并用吉姆薩染色,顯微鏡下計數細胞克隆形成數目(以大于50個細胞為克隆形成標準),計算平均克隆形成率。克隆形成率=(實驗組克隆數/接種數)/(對照克隆數/接種數)。

1.7 動物實驗 將8×106個培養至對數期的Hep-2R細胞,消化后均分于4支1.5mL EP管中,離心并洗滌3次,去除培養基中牛血清,分組處理細胞。對照組:加入1mL生理鹽水;TNF-α組:加入1mL含400u/mL TNF-α的生理鹽水;放療組:細胞置于無菌平皿中接受放療;TNF-α聯合放療組:1mL含400u/mL TNF-α處理細胞后接受放療。收集細胞,用無血清1640制成每0.2mL含1×106個細胞懸液,用微量注射器注入0.2mL于裸鼠右肋皮下,每組細胞接種5只裸鼠。30d觀察期內,每周測量小鼠瘤體大小,記錄數據。30d后,處死小鼠,小心剝離瘤體并用天平秤取重量。求取每組小鼠的平均抑瘤率。

2 結 果

2.1 M TT法檢測生長抑制率 放射抗拒性人喉鱗癌細胞Hep-2R經不同濃度T NF-α處理后,MT T實驗結果顯示:不同濃度TNF-α對Hep-2R細胞均有明顯的生長抑制作用,且抑制作用具有濃度依賴性,持續作用 24h,400u/mL的 TNF-α可產生對腫瘤細胞50%的抑制作用,達到較理想的藥物量效濃度,再增加藥物濃度,TNF-α對Hep-2R細胞的生長抑制作用增長減緩。而TNF-α對Hep-2R細胞的生長抑制效應對時間的依賴性并不明顯(圖1)。

2.2 T UNEL法檢測細胞凋亡 經過不同方式處理的Hep-2R細胞,利用親和素標記的異硫氨酸熒光素染色,在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡并計算其凋亡率,結果顯示:不給予任何處理的對照組細胞凋亡率為(6.0±1.1)%,給予 TNF-α處理的Hep-2R細胞凋亡率為(21.0±2.8)%,而 TNF-α聯合放療處理的細胞凋亡率可達(48.0±3.7)%,三者間差異有統計學意義(P＜0.05);在實驗中,設置的陽性對照和陰性對照細胞凋亡率分別為70%和4%(圖2)。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 放射抗拒性人喉鱗癌細胞Hep-2R經TNF-α處理和聯合放療處理后,流式細胞術檢測細胞凋亡指數(apoptosis index,AI),結果表明:不加任何處理的細胞、單純 TNF-α處理組細胞和TNF-α聯合放療處理組細胞的凋亡指數分別為 1.2±0.3、3.6±0.5和 6.6±0.7,其對應的凋亡率分別為(10±1.3)%、(30±2.2)%和(55±2.7)%,三者間比較差異有統計學意義(P＜0.05),單用 TNF-α即可誘導放射抗拒性人喉鱗癌細胞 Hep-2R的顯著凋亡,與放療聯用時,凋亡誘導作用明顯增加(圖3)。

圖1 TNF-α對Hep-2R細胞生長抑制的時間和劑量依賴性

圖2 TUNEL法檢測 TNF-α誘導Hep-2R細胞凋亡(熒光顯微鏡×100)

圖3 流式細胞術檢測TNF-α誘導Hep-2R細胞的凋亡

2.4 凋亡相關基因Bax檢測 Hep-R細胞經過TNF-α單獨處理和聯合放療處理后,RT-PCR法檢測細胞中凋亡相關基因Bax的活性亞基 Baxα的表達水平,結果顯示:經過 Bandscan軟件灰度掃描,不經任何處理的Hep-R細胞Baxα呈現基礎表達水平,其灰度值平均為28±2,而 TNF-α處理的 Hep-R細胞Baxα基因表達明顯上調,其灰度值為 45±3,TNF-α聯合放療處理細胞后,Baxα基因表達出現協同增加效應,灰度值達到88±3,數據顯示差異有統計學意義(P＜0.05)(圖4)。

2.5 體外克隆形成實驗 放射抗拒性Hep-2R細胞分別單用TNF-α處理、單用放療處理和 TNF-α聯合放療處理后,體外克隆形成實驗計算克隆形成率,求取平均值,實驗結果顯示:以未作任何處理的空白對照細胞的克隆形成率作為對照,單用放療處理的、單用TNF-α處理的和 TNF-α處理聯合放療處理的Hep-2R細胞克隆形成率分別為(58±2)%、(80±3)%和(39±2)%,三者間比較差異有統計學意義(P＜0.05)(圖5)。

圖4 RT-PCR檢測 Baxα基因表達

圖5 體外克隆實驗直方圖

2.6 裸鼠移植瘤實驗 相同數目的放射抗拒性Hep-2R細胞,在分別接受單用放療處理、單用 TNF-α處理和 TNF-α處理聯合放療處理后接種裸鼠,觀察期結束,處死荷瘤小鼠,求取各組小鼠的平均抑瘤率,結果顯示:單用 TNF-α處理、單用放療處理和TNF-α處理聯合放療處理組小鼠的抑瘤率分別為(15.2±1.9)%,(35.4±2.1)%和(55.1±2.9)%,三者比較差異有統計學意義(P＜0.05),說明TNF-α有明顯的放療增敏作用。

3 討 論

TNF-α是一種能直接殺傷腫瘤細胞的多肽細胞因子,也是目前發現的抗腫瘤活性最強的細胞因子之一。TNF-α的抗腫瘤作用不僅表現在其具有直接的腫瘤細胞毒性和細胞生長抑制作用,而且與其他治療方式聯合應用可能發揮更大的抗腫瘤效應。

諸多的研究顯示,TNF-α的直接抗腫瘤效應首先體現在對腫瘤細胞生長增殖的抑制。焦偉[5]報道外源性TNF-α能明顯抑制體外培養的CNE3細胞的生長增殖,且該抑制效應具有劑量和時相依賴性的特點。本研究分別采用T NF-α的4個不同的藥物濃度梯度作用腫瘤細胞Hep-2R,M TT實驗檢測細胞的增殖情況,結果顯示:不同濃度 TNF-α對Hep-2R細胞均有生長抑制作用,且抑制作用具有濃度依賴性,這與焦偉的研究結果一致。但在本研究中,在作者的實驗條件下并未發現TNF-α對Hep-2R細胞的生長抑制效應具有明顯的時間依賴性,推測這可能與不同腫瘤對 TNF-α的敏感性存在差異[6]。

TNF-α能夠誘導細胞凋亡的生物學功能最初在正常細胞的炎癥損傷研究中被證實[7]。隨著腫瘤發生、發展觀念不斷豐富,腫瘤細胞凋亡受阻已被證實為惡性腫瘤發生、發展過程中的重要生物學特征。Liu等[8]在門靜脈癌栓標本中檢測到了肝癌細胞的高凋亡率與 TNF-α高表達的正相關性。劉大慶等[9]的實驗則報道應用細胞計數、DNA降解片段瓊脂糖凝膠電泳觀察及電鏡觀察等手段檢測到,rhTNF-α作用MEC-1細胞后,細胞出現大量的凋亡現象。本研究應用TUNEL法和流式細胞術均檢測到,單用TNF-α即可明顯誘導放射抗拒性人喉癌細胞的凋亡,而聯用常規分割劑量2Gy/次照射后,這種促凋亡效應協同增加。另有報道,化療也可對TNF-α的促凋亡作用產生協同作用[10-11]。

Wang等[12]和Sun等[13]分別在體內外證實了 TNF-α促進腫瘤細胞凋亡可能與Bcl-2的表達抑制有關。而Bcl-2相關X蛋白(Bax)可與抗凋亡基因Bcl-2形成異源二聚體,具有抑制Bcl-2,促進細胞凋亡的作用,Bcl-2與Bax二者之間的比例決定了細胞的命運。本研究發現,TNF-α處理的人喉癌細胞BaxαmRNA的表達水平高于未經任何處理的母本細胞的表達水平,從而推測TNF-α誘導人喉癌細胞凋亡是通過上調Bax基因/蛋白的表達水平來實現的。這從另外一個角度進一步證實了凋亡相關基因在TNF-α誘導腫瘤細胞凋亡中扮演角色。但Meng等[14]報道的研究結果認為,TNF-α誘導人涎腺腺樣囊性癌細胞SACC的凋亡與P53蛋白陽性表達的增加有明確的正相關性,而Bcl-2蛋白不但與此無負相關性,相反在凋亡的早期反而表達增加,推測可能是檢測凋亡相關基因的時間與細胞凋亡出現的時間不同步。

增殖和凋亡情況是決定腫瘤細胞接受放射線照射后最終命運的兩個最重要因素。腫瘤細胞生長抑制和(或)凋亡增加則放射敏感,反之放射抗拒。本實驗利用經典的放射敏感性檢測手段研究了TNF-α對Hep-2R細胞的放療增敏作用,結果顯示:T NF-α本身可以通過抑制細胞增殖和促進細胞凋亡降低Hep-2R的克隆形成率,并且能夠同放射線的殺傷作用形成協同效應。在裸鼠移植瘤實驗也得到了一致的研究成果。與本研究結果一致的是,Yuan等[15]證實了TNF-α對原發性放射抗拒性鼻咽癌細胞的放療增敏效應。Herzog等[16]進一步發現,T NF-α不僅能增加放療對敏感細胞的殺傷作用,還能使對放療耐受的細胞變得敏感。值得提出的是,本研究采用的是放射誘導的放射抗拒性Hep-2R細胞,這一細胞群體既包含了自身放射抗拒的細胞群也包含了放射誘導的細胞群,能更好地反映臨床患者放療過程中細胞群的組成變化。此外,TNF-α在乏氧反應元件的調控下還能實現顯著的放射乏氧增敏[17]。

總之,為研究TNF-α對放療的增敏作用,本實驗將 TNF-α作用于放射抗拒性人喉癌細胞Hep-2R,通過生長抑制實驗、凋亡檢測實驗和放射敏感性檢測,在體外初步證實了,TNF-α是通過對Hep-2R細胞的生長抑制和誘導凋亡作用從而有效地起到了放療增敏作用,進而為臨床應用TNF-α放療增敏提供了實驗基礎和理論依據。

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