老年和成年大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙模型的建立與比較

曹 劍,李 鵬,易 斌 ,羅鐵山,石勝馳,陶國(guó)才

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院麻醉科,重慶400038)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥,研究報(bào)道中年患者接受手術(shù)后1周POCD發(fā)生率為19.7%,并有6.2%患者認(rèn)知障礙持續(xù)到3個(gè)月以后[1],而老年患者 POCD的發(fā)生率更高,影響也更大[2]。對(duì)POCD病因及機(jī)制研究也成為科研熱點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察經(jīng)麻醉和手術(shù)處理后的大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的改變,旨在為制備和選擇研究POCD發(fā)生機(jī)制的動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇及分組 SD雄性老年大鼠(月齡22個(gè)月)30只,體質(zhì)量500～600 g;SD雄性成年大鼠(月齡4個(gè)月)30只,體質(zhì)量200～260 g,由成都達(dá)碩生物科技有限公司動(dòng)物中心提供。老年大鼠隨機(jī)分為3組(n=10):老年對(duì)照組(C1組),老年麻醉組(I1組),老年麻醉手術(shù)組(O1組)。成年大鼠隨機(jī)分為3組(n=10):成年對(duì)照組(C2組),成年麻醉組(I2組),成年麻醉手術(shù)組(O2組)。

1.2 動(dòng)物模型建立 采用自制透明麻醉吸入箱(用透明玻璃制成50 cm×40 cm×40 cm大小)實(shí)施吸入麻醉,麻醉箱一側(cè)孔接Drager Fabius型麻醉機(jī)(德國(guó) Drager公司),另一側(cè)孔接solar 8000M型多功能監(jiān)測(cè)儀(GE公司,美國(guó)),監(jiān)測(cè)流出氣體中麻醉氣體濃度。麻醉組均進(jìn)行1.5%異氟醚吸入麻醉2 h,麻醉箱中保持30%氧濃度。麻醉手術(shù)組大鼠在吸入箱中麻醉后迅速移入預(yù)充相同氣體及吸入麻醉藥的自制大鼠面罩內(nèi)進(jìn)行麻醉及手術(shù),行右側(cè)股動(dòng)脈插管接多功能監(jiān)護(hù)儀,腹部皮膚剪去毛發(fā),消毒后取腹正中切口約5 cm進(jìn)行腹腔探查術(shù),依次探查腸道、肝、脾、腎等臟器,手術(shù)持續(xù)時(shí)間2 h。術(shù)中持續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠動(dòng)脈血壓、血氧飽和度、心率、呼吸、肛溫,并給予腹腔加溫生理鹽水滴注補(bǔ)液及保溫處理。術(shù)中0.5、1、2 h抽取動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治觥Ｐg(shù)中保持嚴(yán)格無(wú)菌操作,術(shù)后給予腹腔注射青霉素鈉50 u/g,1次/天,預(yù)防感染,直至傷口完全愈合、拆線。對(duì)照組動(dòng)物不進(jìn)行任何處理。

1.3 動(dòng)物學(xué)習(xí)及行為學(xué)測(cè)試

1.3.1 水迷宮實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物建模后1 d與對(duì)照組進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試,采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組的空間學(xué)習(xí)記憶能力。將水池等分為四象限,在第四象限正中離池壁20 cm處放透明平臺(tái),平臺(tái)頂?shù)陀谒? cm。訓(xùn)練期間迷宮外參照物保持不變。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation test):實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間,即逃逸潛伏期(escape latency),120 s找不到平臺(tái),潛伏期記為120 s。每次訓(xùn)練取四個(gè)象限平均值為當(dāng)天成績(jī)。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe test):訓(xùn)練完畢次日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),撤除平臺(tái),記錄大鼠120 s內(nèi)穿過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)和在原平臺(tái)象限即第四象限探索時(shí)間作為空間記憶成績(jī)[3]。

表1 各組大鼠水迷宮測(cè)試逃避潛伏期比較(n=10, ±s,s)

表1 各組大鼠水迷宮測(cè)試逃避潛伏期比較(n=10, ±s,s)

*:與C1組比較,P＜0.05;#:與I1組比較,P＜0.05;△:與C2組比較,P＜0.05;▲:與I2組比較,P＜0.05。

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天C1組 52.34±10.21 22.53±6.43 10.76±2.42 10.35±3.52 9.32±2.53 I1組 54.65±12.14 28.42±5.14* 18.51±3.67* 14.79±2.27* 13.17±3.65*O1組 53.32±10.64 33.72±5.69* 22.65±3.52* 18.42±3.52*# 17.26±5.18*#C2組 52.25±13.33 21.99±6.52 9.32±2.25 8.62±2.55 7.42±2.91 I2組 54.63±17.43 22.87±6.21 11.61±3.39 9.19±2.61 8.25±2.39 O2組 57.51±17.92 25.53±6.04△ 18.37±3.28△▲ 16.65±4.63△▲ 14.67±3.73△▲

1.3.2 電腦控制的穿梭箱系統(tǒng) 本系統(tǒng)以燈光為條件刺激,足底電擊為非條件刺激。大鼠在接受燈光刺激后即能進(jìn)行穿梭運(yùn)動(dòng)為主動(dòng)回避反應(yīng)(active avoidance reaction,AAR),如需進(jìn)行電擊而完成穿梭稱為被動(dòng)回避反應(yīng)(passive avoidance reaction,PAR)。按參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行訓(xùn)練5 d,每次進(jìn)行20輪光電刺激,動(dòng)物先在暗箱內(nèi)適應(yīng)5 min,開始時(shí)給予持續(xù)燈光刺激5 s,如大鼠不逃至另一端,則給予電擊(電流3 mA、頻率15 Hz),使動(dòng)物逃至箱底不通電的另一端,此時(shí)電擊停止,否則持續(xù)受電擊5 s。間隔60 s重復(fù)上述刺激。分別在麻醉、手術(shù)處理后第5天,1、2、4周進(jìn)行穿梭箱實(shí)驗(yàn)測(cè)試。大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力以完成AAR的次數(shù)與測(cè)試總次數(shù)的比值即AAR比率代表[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。數(shù)據(jù)以±s表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)以及Post Hoc Tests多重比較檢驗(yàn)(multiple Comparisons)法。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)中情況 兩組大鼠術(shù)中生命體征平穩(wěn),未發(fā)現(xiàn)低血壓、缺氧、二氧化碳儲(chǔ)留及酸堿平衡紊亂。

2.2 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果 與C1組比較,I1組與O1組手術(shù)后在訓(xùn)練第2天均開始出現(xiàn)逃逸潛伏期延長(zhǎng)(P＜0.05),并持續(xù)到訓(xùn)練測(cè)試結(jié)束,而O1組在訓(xùn)練第4天及測(cè)試當(dāng)天逃逸潛伏期長(zhǎng)于I1組(P＜0.05)。I2組逃逸潛伏期與C2組比較未見(jiàn)顯著差異,從第2天開始O2組表現(xiàn)出逃逸潛伏期延長(zhǎng)(P＜0.05)(表1)。空間探索實(shí)驗(yàn)顯示:與C1組比較,I1組穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P＜0.05),O1組探索時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)均減少(P＜0.05)。I2組與C2組比較未見(jiàn)明顯差異,但O2組探索時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)均較C2、I2組減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表 2。

表2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(n=10, ±s)

表2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(n=10, ±s)

*:與C1組比較,P＜0.05;△:與 C2、I2組比較,P＜0.05。

組別 空間探索時(shí)間(s)穿越平臺(tái)次數(shù)(次)C1組 48.55±6.92 7.15±2.50 I1組 46.94±7.23 5.30±2.17*O1組 37.28±6.27* 4.14±2.30*C2組 57.53±12.51 8.60±2.21 I2組 54.23±11.52 7.80±2.27 O2組 45.32±10.74△ 3.50±1.77△

2.3 穿梭箱測(cè)試結(jié)果 與C1組比較,I1組第5天時(shí)主動(dòng)回避率降低。O1組直至第2周仍較C1組低,第4周未見(jiàn)明顯差異。I2組各時(shí)相點(diǎn)與C2組比較未見(jiàn)明顯差異,但O2組與C2組比較第5天及1周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠實(shí)驗(yàn)因素處理后各時(shí)相點(diǎn)AAR結(jié)果(n=10, ±s,%)

表3 各組大鼠實(shí)驗(yàn)因素處理后各時(shí)相點(diǎn)AAR結(jié)果(n=10, ±s,%)

*:與C1組比較,P＜0.05;#:與 I1組比較,P＜0.05;△:與 C2、I2組比較,P＜0.05。

組別 第5天 1周 2周 4周C1組 92.43±7.26 92.35±6.53 89.43±8.32 90.41±6.50 I1組 83.27±6.14* 87.42±5.14 88.36±5.62 87.42±8.08 O1組 70.32±10.26*#78.76±6.39*#81.53±6.17*#86.82±4.72 C2組 93.24±4.62 91.99±6.42 88.31±4.29 89.62±6.55 I2組 90.32±5.43 89.59±6.85 88.61±4.09 88.49±4.08 O2組 76.11±9.12△ 80.51±6.93△ 85.84±5.18 86.04±4.06

3 討 論

POCD在臨床并不少見(jiàn),隨著社會(huì)老齡化加劇,接受麻醉與手術(shù)的老年患者比例增加,POCD發(fā)生率也呈上升趨勢(shì)。關(guān)于POCD發(fā)生率各研究報(bào)道不一,但毋庸置疑的是POCD的發(fā)生不僅延長(zhǎng)住院時(shí)間、增加費(fèi)用支出、同時(shí)增高發(fā)病率及病死率[6]。關(guān)于術(shù)后認(rèn)知功能的研究也成為科研熱點(diǎn),然而POCD的發(fā)生機(jī)制仍然不明確,目前認(rèn)為有多種因素與POCD的發(fā)生相關(guān),如麻醉方法、麻醉藥、手術(shù)類型、基礎(chǔ)健康狀況、并發(fā)癥、缺氧、低血壓、年齡、基礎(chǔ)認(rèn)知能力及基因差異等。但目前較明確的是POCD在老年患者發(fā)生率較高[2]。研究報(bào)道術(shù)中應(yīng)用吸入麻醉藥異氟醚后對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能影響明顯[7],而臨床報(bào)道腹部手術(shù)后POCD較常見(jiàn),因此本研究應(yīng)用異氟醚麻醉大鼠并進(jìn)行剖腹探查術(shù),盡可能模擬臨床手術(shù)麻醉過(guò)程,術(shù)后通過(guò)行為學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)處理因素對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響。

由于低血壓、感染以及術(shù)中缺氧等因素可能影響POCD的發(fā)生[8],因此本研究進(jìn)行了血壓、心率、血?dú)饧绑w溫監(jiān)測(cè),以排除其他因素干擾,術(shù)后給予抗生素防止傷口感染。Morris水迷宮是一種研究與學(xué)習(xí)記憶功能直接相關(guān)的測(cè)試方法,逃逸潛伏期直接反映了空間信息獲取的學(xué)習(xí)能力,空間探索實(shí)驗(yàn)反映了記憶儲(chǔ)存及提取再現(xiàn)的能力。而穿梭箱實(shí)驗(yàn)以光、電擊為聯(lián)合刺激,使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由被動(dòng)回避建立主動(dòng)的條件反射。記錄此條件反射建立過(guò)程中的AAR指標(biāo)可反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)、記憶能力的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在成年大鼠中,麻醉并沒(méi)有對(duì)大鼠認(rèn)知能力產(chǎn)生明顯影響,而老年大鼠卻表現(xiàn)出認(rèn)知能力下降,但在1周時(shí)并未見(jiàn)與對(duì)照組存在差異,說(shuō)明異氟醚對(duì)老年大鼠的認(rèn)知功能影響隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減小。麻醉手術(shù)后大鼠均出現(xiàn)認(rèn)知能力下降,老年大鼠尤為明顯,并且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),說(shuō)明手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激在POCD中發(fā)揮了重要的作用。既往研究也報(bào)道了腹部手術(shù)后大鼠認(rèn)知功能下降[9],而研究報(bào)道局部麻醉與全身麻醉后POCD的發(fā)生率并未有明顯的差別,同樣提示了POCD發(fā)生機(jī)制與手術(shù)創(chuàng)傷的關(guān)系[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明異氟醚吸入麻醉和剖腹探查手術(shù)引起的術(shù)后認(rèn)知能力下降在不同年齡大鼠中表現(xiàn)出不同的影響,而尤其以手術(shù)對(duì)認(rèn)知功能影響較大,同時(shí)老年大鼠更易發(fā)生認(rèn)知能力損害。

綜上所述,本研究通過(guò)模擬臨床麻醉、手術(shù)過(guò)程,成功構(gòu)建了術(shù)后認(rèn)知功能損害的大鼠模型,并比較了麻醉手術(shù)對(duì)成年和老年大鼠認(rèn)知功能影響的差別,為今后研究POCD發(fā)生機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)。由于POCD發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜,就目前研究水平來(lái)看,POCD的模型建立尚缺乏一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的處理方法及評(píng)價(jià)金標(biāo)準(zhǔn),目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者傾向于通過(guò)動(dòng)物組間行為學(xué)差異來(lái)認(rèn)定認(rèn)知能力的下降,而建立一個(gè)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化處理方案及判斷金標(biāo)準(zhǔn)仍然是努力的方向。

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