BRD-2基因在急性淋巴細胞白血病中表達的臨床研究

范 紅,程遠東,孫 哲,呂曉東

(1.鄭州大學第五附屬醫院干部病房,河南鄭州450052;2.鄭州大學第一附屬醫院血液科,河南鄭州450052;3.河南省腫瘤醫院腫瘤研究所,河南鄭州450052)

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種多基因異常所致的血液系統惡性疾病,包括了復雜的基因突變、缺失、擴增、癌基因激活、抑癌基因失活以及融合基因轉錄等多種分子生物學水平的異常。基因治療為其提供了一種高度特異性的治療手段,應用標記基因能夠更準確地掌握患者接受免疫治療后以及腫瘤特異性殺傷細胞在體內存在、分布及活性等方面的信息[1]。迄今為止,ALL的發病和或復發機制并未完全清楚,故尋找新的白血病相關基因一直是這一領域的研究熱點。篩選出表達異常和功能異常的白血病相關基因不僅有助于闡明白血病發生、發展的機制,而且為找到新的治療靶位點提供可能[2]。BRD-2是一種與細胞的增殖和凋亡相關的基因,但其與ALL的相關性研究報道很少。本研究對78例A LL患者BRD-2 mRNA表達水平進行了檢測,探討其在ALL患者中的表達情況及其與預后的關系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2004年1月至2008年12月鄭州大學附屬第五醫院和河南省腫瘤醫院收治的ALL患者78例,男38例,女40例,中位年齡23歲(14～68歲)。健康對照外周血 35份,取自異基因干細胞移植患者的健康供者及健康體檢者,其中男20例,女15例,平均年齡26歲(16～48歲)。

1.2 半定量 RT-PCR 取外周血5 mL或骨髓2 mL,用Ficoll方法收集1×107個細胞,細胞總 RNA用 TRIzol抽提試劑盒提取,-80℃保存。引物均由上海生工生物工程公司合成。BRD-2 上游引物:5′-CTG CCT ATG CTG GCC ZTTC-3′;下游引物:5′-TCC TCC TCG TCC TCC TCA TC-3′;擴增長度455 bp。β-actin 作為內參,上游引物:5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC-3′;下游引物 :5′-CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC-3′,擴增長度271 bp。逆轉錄反應:使用 Promega公司ImProm-IITM Reverse Transcription System試劑盒,步驟為:70℃5 min,42℃60 min,25℃5 min。cDNA作為PCR反應的模板,-20℃保存備用。PCR擴增:β-actin作為內參照與BRD-2基因的引物一起擴增。PCR反應體系25 μ L,包括 cDNA 1.6 μ L,10×Mg free buffer 2.5μ L,25 mmol/L M gCl21.5 μL,10 mmol/L dNTP 0.5 μL,BRD-2 上下游引物終濃度為0.4 umol/L,β-actin上下游引物終濃度為0.2 μ mol/L,Taq聚合酶1.5 u,用去離子水補足至25 μ L。擴增的循環參數:94℃變性5 min,再94℃30 s,62℃30 s,72℃40 s,共28個循環,循環結束后72℃延伸5 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后使用BIO-RAD凝膠掃描系統進行分析,用目的基因與β-actin電泳條帶熒光強度的比值來檢測目的基因轉錄水平。

1.3 治療方法 78例ALL患者均采用VDP方案(長春新堿、柔紅霉素、潑尼松)、CODP方案(環磷酰胺、長春新堿、柔紅霉素、潑尼松)[3]誘導化療 2個療程,其中 40例青少年患者在不同階段接受不同形式的造血干細胞移植。移植前狀態包括:第1個療程達到完全緩解(CR1)者20例、第2個療程達到完全緩解(CR2)者10例、部分緩解(PR)2例、復發狀態8例。移植方式包括:骨髓移植20例、外周血干細胞移植15例、臍血移植5例。其中非血緣關系(包括骨髓或臍血)移植15例、親屬間(包括骨髓或外周血干細胞)移植11例、自體外周血干細胞移植14例。其余38例患者在VDP、CODP方案基礎上加用中劑量甲氨蝶呤(M TX)、中劑量阿糖胞苷(Ara-C)、鬼臼乙叉甙(Vp16)等鞏固強化治療;CR半年以上者接受巰嘌呤(6-MP)、MTX維持治療;定期應用M TX、Ara-C、地塞米松(Dex)二或三聯鞘內注射預防中樞神經系統白血病。

1.4 療效判斷 參照《血液病診斷及療效標準》第2版。

1.5 統計學處理 采用SPSS11.5軟件進行統計學分析,計數資料采用χ2檢驗,計量資料采用方差分析,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BRD-2 mRNA陽性率 78例 ALL患者 BRD-2 mRNA陽性率為75.31%,明顯高于健康對照組(37.14%,P＜0.05)。ALL患者BRD-2 mRNA的表達水平(0.912±0.137)高于健康對照組(0.466±0.209,P＜0.01)。見圖1。

圖1 BRD-2 mRNA表達情況

2.2 3年無病生存(DFS)率BRD-2 mRNA陰性ALL患者3年DFS率為47.43%,優于BRD-2mRNA陽性表達患者(32.55%),差異有統計學意義(P＜0.05)。40例肝細胞移植患者中,CR1期移植組的3年DFS率優于CR2、PR、復發狀態移植者,差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討 論

BRD-2基因是從T細胞文庫中克隆出來的,包括一個開放閱讀框,編碼的蛋白質含754個氨基酸[3],是促細胞活化的絲/蘇氨酸激酶,該酶定位于細胞核。BelAiba等[4]研究表明該酶專一性地存在于胞核內,細胞增生時活性增高,并且發現在ALL、慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者該酶的活性也顯著升高。提示這種胞核激酶是信號傳導通路上的組分之一,在細胞周期應答中發揮作用,這種功能的發揮與E2F轉錄因子家族相關[5]。E2F既可控制細胞的增殖,又能誘導細胞凋亡,既能促進腫瘤的發生,又能抑制腫瘤的發生,既有轉錄激活作用,又有轉錄抑制作用,原因在于E2F的雙重調節功能是相互獨立的,其調節作用的發揮與其量的水平有很大關系。Guo等[6]發現BRD-2是一種新的與人類白細胞增多癥有關的蛋白激酶,包括兩個高度保守的溴結合區。BRD-2可促進E2F調控細胞周期的進展,該機制的異常可能是白細胞增多的遺傳因素。Mungall等[7]的報道再次證實BRD-2在白血病患者的白細胞中活性很高,提示這種酶可能參與了白血病和其他增生性疾病的發病機制。

本研究結論表明,BRD-2基因在ALL患病組表達水平高于健康對照組,差別有統計學意義,提示該基因可能與ALL的發病有某種相關性,但其確切機制及調控方式仍有待于進一步研究。

大部分學者認為,ALL單純化療的長期生存率低,只要有人類白細胞抗原(HLA)相合的同胞供者都應在CR1期進行異基因移植[8]。本組發現BRD-2 mRNA陽性表達患者的3年DFS率明顯低于BRD-2 mRNA陰性表達的患者,而且40例患者接受移植,其中異基因移植26例,自體移植14例,結果顯示,異基因移植的長期生存率優于化療,但由于樣本數量有限,隨訪時間較短,還有待大規模隨機對照試驗確定ALL的移植適應證和移植時機。

綜上所述,BRD-2基因異常表達在ALL的發生、發展中可能起重要作用,檢測該基因可作為臨床診斷及預后評估指標。但是BRD-2基因是否是一個新的白血病相關基因,其在白血病的發生、發展及復發中究竟起什么作用,這些問題的解決有待于更深入的實驗研究。

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[3]Pal DK,Evgrafov OV,Tabares P,et al.BRD2(RING3)is a probable major susceptibility gene for common juvenile myoclonic epilepsy[J].Am J Hum Genet,2003,73(2):261.

[4]BelAiba RS,Baril P,Chebloune Y,et al.Identification and cloning of an 85-kDa protein homologous to RING3 that is upregulated in proliferating endothelial cells[J].Eur J Biochem,2001,268(16):4398.

[5]Denis GV,Vaziri C,Guo N,et al.RING3 kinase transactivates promoters of cell cycle regulatory genes through E2F[J].Cell Growth Differ,2000,11(8):417.

[6]Guo N,Faller DV,Denis GV.Activation-induced nuclear translocation of RING3[J].Cell Sci,2000,113(17):3085.

[7]Mungall AJ,Palmer SA,Sims SK,et al.The DNA sequence and analysis of human chromosome 6[J].Nature,2003,25(6960):805.

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