FHIT基因的MSI、LOH及甲基化修飾與胃癌關系的研究*

胡宏波,賈安平,劉振鵬,鄭 玲,梁秀蘭,馮 金,詹前美

(廣西壯族自治區柳州市柳鐵中心醫院:1.檢驗科;2.消化內科,廣西柳州545007)

脆性組氨酸三聯體(fragile histidine triad,FHIT)基因是抑癌基因,位于人類染色體3p14.2上,其cDNA由 10個外顯子組成,外顯子5～9組成一長約500 bp的開放性閱讀框,編碼一個由147個氨基酸組成的相對分子質量為16.8 kd的蛋白質。該基因表達蛋白參與一系列的細胞進程,包括對細胞周期調控、細胞凋亡和微管活動的調節以及二腺苷三磷酸(AP3A)的水解等[1]。該基因內含FRA3B脆性位點,易斷裂,斷裂后使該基因失活,引起細胞異常增生,最終導致腫瘤的發生。本研究對胃癌FHIT基因遺傳學和表觀遺傳學的改變進行檢測,探討FHIT基因的異常改變在胃癌的發生和發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2006年1月至2009年10月本院腔鏡中心胃鏡檢查并經病理證實為胃癌的患者74例,男46例,女28例,年齡36～87歲,平均58.5歲;所有患者均取病變組織和正常胃黏膜組織各一份,樣本離體后30 min內均迅速放置于-80℃冰箱中。臨床病理學分期采用國際抗癌聯盟1997修訂的TNM分期標準,其中Ⅰ期 19例,Ⅱ期13例,Ⅲ期 22例,Ⅳ期20例。Lauren分型:腸型28例,彌漫型33例,混合型13例。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 參照大連TaKaRa公司試劑盒說明書進行,提取產物用美國Bio-Rad公司SmartSpec plus核酸測定儀檢測DNA的濃度和純度,如OD260/OD280在1.6～1.8則置于-20℃的冰箱備用。

1.2.2 FHIT基因微衛星不穩定(MSI)和雜合性缺失(LOH)分析 利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增微衛星標記D3S1300,D3S1300引物和擴增參數見表1。PCR反應體系的構成:Taq酶 0.5 μ L,模板 DNA 2.5 ng,上游引物(20 μ mol/L)1 μ L,下游引 物(20 μ mol/L)1 μ L,GC Buffer I 25 uL,dNTP(含Mg2+)8μL,滅菌蒸餾水加至 50 μ L。PCR產物行3%瓊脂糖電泳(80 V,120 min),結果經美國Bio-Rad公司Gel DocTMXR凝膠成像系統進行分析。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)采用美國Bio-Rad公司Mini P-4垂直凝膠電泳系統。配制8%聚丙烯酰胺凝膠:30%的丙烯酰胺4 mL、5×TBE 3 mL 、10%過硫酸胺 0.11 mL、T EMED 10 μ L,加ddH2O至總體積15 mL。灌膠并插好梳子,待膠凝固移去樣品梳后,加入1×TBE于上下兩電泳槽內,用1×TBE沖洗加樣孔,樣品點樣(10 μ L 擴增產物與 2 μ L 6×DNA Loading Buffer混合),60 V電壓進行電泳,觀察溴酚藍完全泳出凝膠時結束。將凝膠小心剝入0.5μ g/mL EB溶液中,室溫染色30 min,用ddH2O沖洗凝膠 2次,將凝膠移至 Bio-Rad凝膠成像儀下照相,保存。結果判斷:選擇基因組DNA等位片段表現為雜合子者進行LOH分析,純合子則為無信息個體。與正常胃黏膜組織相比,癌組織PCR擴增產物出現等位基因條帶的增多或位置的移動判定為 MSI,條帶消失或相對密度減少50%以上判定為LOH。

表1 FHIT基因引物和擴增參數

表2 FHIT基因MSI和LOH及甲基化修飾與胃癌臨床指標的關系

1.2.3 甲基化特異性PCR(MSP-PCR)甲基化修飾參照美國Epigentek公司產品說明書進行;將已修飾的DNA分別用甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物進行PCR擴增。FHIT基因引物設計參照文獻[2],引物和擴增參數見表1。PCR反應體系構成、產物電泳及成像同1.2.2。將經電泳鑒定存在單一明亮目的條帶的未純化PCR產物各取 50 μ L,即FHIT-M和FHIT-U為引物的PCR產物各1管,送廣西醫科大學醫學科學實驗中心進行序列測定。

1.3 統計學處理 應用SPSS13.0統計分析軟件進行χ2檢驗或者Fisher精確檢驗,相關性分析采用Spearman檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 FHIT基因MSI和 LOH 74例胃癌患者中,59例為提供信息的雜合子個體,其中MSI有14例,占 23.7%;LOH的有17例,占 28.8%,二者總和為 31例,占 52.5%(圖 1)。FHIT基因MSI和LOH均與胃癌患者年齡、性別、Lauren分型、Borrmann分型、淋巴結轉移以及 TNM 分期無關(P＞0.05),但 LOH與浸潤程度存在正相關(P＜0.05),見表2。

2.2 FHIT基因的甲基化特異性 PCR(MSP)擴增結果 FHIT基因行MSP擴增后,產物經瓊脂糖凝膠電泳得到約79 bp特征性片段,與預期的FHIT-M和FHIT-U為引物的目的片段大小相符,見圖2。

2.3 FHIT基因的MSP擴增后的測序結果 甲基化片段所有CpG位點保持不變,非甲基化片段所有C變成T。兩結果對比證實,有CpG二核苷酸存在于序列中則為甲基化的CpG,而在對應位置為TpG則為非甲基化的CpG。

2.4 FHIT基因甲基化狀態 正常胃黏膜組織均為FHIT基因非甲基化,74例胃癌組織中FHIT基因甲基化陽性為38例,檢出率為51.4%,其中完全甲基化9例。FHIT基因甲基化率在正常胃黏膜組織和胃癌組織中差異有統計學意義(P＜0.05)。FHIT基因甲基化與胃癌患者年齡、性別、Lauren分型、Borrmann分型、浸潤程度、淋巴結轉移以及TNM 分期無關(P＞0.05),見表2。

圖1 D3S1300位點MSI和 LOH

圖2 胃癌組織FHIT基因的MSP分析

2.5 胃癌FHIT基因甲基化與MSI和LOH之間的關系 59例雜合子中共有27例發生甲基化,27例甲基化樣品中8例MSI和9例 LOH,32例未甲基化樣品中 6例 MSI和 7例LOH,甲基化與MSI和LOH均不存在明顯相關性(P＞0.05,r=0.12和0.13)。

3 討 論

DNA錯配修復系統(M MR)是指存在人類細胞中的一種修復DNA堿基錯配的保障體系,其主要功能是修復DNA復制過程中產生的單堿基錯配和2個以上的插入/缺失(IDLs)錯配。當MM R出現不穩定性變化或功能缺陷時,與其連鎖或相關的微衛星位點易發生MSI導致DNA序列的微妙變化和(或)LOH導致的染色體不穩定性,在胃癌組織中存在高頻率的MSI和LOH,FHIT基因所在的染色體3p14.2區域的遺傳改變頻繁表達于胃癌和其他腫瘤[3]。有研究表明,FHIT基因啟動子區CpG島異常甲基化可導致表觀遺傳學沉默(epigenetic silencing),也是其主要失活方式之一,從而直接參與胃癌的發生[4]。

微衛星是具有高度多態性的短串聯重復核苷酸序列,與同一個體正常組織相比,MSI是指在腫瘤組織基因組中微衛星簡單重復序列的增加或丟失;LOH則是腫瘤組織的某個等位基因消失。有研究表明,抑癌基因MSI與LOH在腫瘤的多步驟發生過程中起著重要的作用[5]。作為FHIT基因的分子標志,微衛星標記D3S1300被認為是檢測FHIT基因M SI和LOH的候選位點。Huiping等[6]的研究顯示,FHIT基因該位點MSI發生率為27.1%(13/48);Lee等[7]報道FHIT基因該位點LOH發生率為21.2%(7/33);肖玉平等[8]檢測了38例胃癌組織FHIT基因表達,結果在D3S1300位點MSI發生率為36.8%(14/38),LOH發生率為26.3%(10/38)。本研究顯示,59例胃癌在 D3S1300位點的MSI發生率 23.7%(14/59),LOH發生率為28.8%(17/59),MSI發生率與肖玉平等的研究結果有一定差異,但其LOH發生率與及其他學者的研究結果較為接近。有學者對胃癌發生機制的研究時提出MSI和LOH是胃癌發生早期事件[9-10];Castagnaro等[11]對FHIT基因與腫瘤的關系研究中發現,FHII基因MSI多發生在預后較好的臨床早期癌組織中,并認為MSI可作為早期分子診斷的標志。本文對FHIT基因的研究結果顯示,MSI和LOH與胃癌患者年齡、性別、Lauren分型、Borrmann分型、淋巴結轉移以及TNM分期無關,亦提示FHIT基因MSI可能用于胃癌的早期診斷;但隨著胃癌逐漸向胃壁深部的浸潤,FHIT基因LOH發生率增加,提示D3S1300位點 LOH多發生于胃癌晚期,并有促進浸潤和遠處轉移的作用。因此,FHIT基因LOH檢測可作為胃癌惡性程度、轉移和預后判斷的重要指標。

由FHIT基因啟動子區高甲基化導致的表達靜默被認為是引起胃癌發生的分子機制之一,并且已經在胃癌組織中得到了證實[4]。本研究的MSP結果顯示,FHIT基因在正常胃黏膜組織均未出現甲基化陽性片段,但在74例胃癌組織中有38例發生甲基化,甲基化率為 51.4%,與 Leal等[12]的研究結果53.9%比較接近,但與文獻[13-14]報道的FHIT基因62%和40%有一定差異,其原因可能與患者的遺傳背景和實驗方法的差異有關。甲基化與胃癌患者年齡、性別、Lauren分型、Borrmann分型、浸潤程度、淋巴結轉移以及TNM 分期無關,提示FHIT基因甲基化可能是胃癌發生的早期事件。本研究還對胃癌FHIT基因甲基化和MSI及LOH進行相關性分析,結果顯示甲基化與后兩者之間均無明顯相關性,提示甲基化與后兩者可能是通過不同的途徑對胃癌的發生、發展起作用,而相互之間并無明顯影響。

總之,FHIT基因失活機制除了以上三個方面,還可能涉及其他方面:染色體不穩定、基因轉錄異常致蛋白表達降低或缺失、純合缺失、基因突變、表觀遺傳學的其他改變(如組蛋白乙酰化)等,FHIT基因結構或表達過程中的變化勢必引起其功能的改變。因此進一步研究FHIT基因在胃癌組織中的其他變化,對確定FHIT基因與胃癌發生、發展的關系有著重要的意義。

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