ERK信號通路與MMP-9在肺腺癌表達中的相關性*

黎 聯,李 敏,周向東

(1.重慶市江津區人民醫院呼吸內科 402260;2.重慶市江津區人民醫院病理科 402260;3.重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸內科 400010)

肺癌發病率高,常發生浸潤和轉移,因此與肺癌侵襲、轉移相關的因子一直是研究的重點。目前研究證實基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在多種癌組織中的表達明顯高于正常組織,在癌的發生、發展中起著重要作用,然而很少有關于M MP-9表達與信號轉導通路關系的研究。細胞外信號調節激酶(extracelluar signal-regulated kinase,ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的重要成員,最近,ERK信號通路以正性調節的方式參與腫瘤的侵襲、轉移過程而倍受關注。為此,本研究檢測磷酸化細胞外信號調節激酶(pERK)、MM P-9在肺腺癌組織中的表達,并進一步在體外研究pERK、MM P-9在肺腺癌細胞中的表達,分析ERK信號通路對肺腺癌細胞M MP-9蛋白表達的影響,評價其臨床應用價值。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇重慶醫科大學附屬第二醫院和重慶市江津區人民醫院67例肺腺癌患者手術切除的肺癌蠟塊(2000年3月至2004年3月),14例癌旁正常組織標本。所有標本均經10%甲醛固定,石蠟包埋,5 μ m厚連續切片。男55例,女 12例,年齡40～82歲,＞60歲的42例,≤60歲的25例。病灶大于3 cm的40例,病灶小于或等于3 cm的27例。伴淋巴結轉移28例,不伴淋巴結轉移39例,所有病例術前未行放化療。據美國聯合癌癥分類委員會(AJCC)和國際抗癌聯盟(UICC)2002年制訂的肺癌TNM分期標準[1]:Ⅰ～Ⅱ期37例,Ⅲ～Ⅳ期30例。

1.2 細胞系 人肺腺癌SPC-A-1由重慶醫科大學基礎醫學研究所已有的細胞復蘇而得,細胞在 37℃、5%CO2、含10%小牛血清的RPMI1640培養液中培養,0.1%胰酶消化傳代。

1.3 主要試劑 RPM I1640培養液購自Gibco公司,胎牛血清購自天津TBD公司,鼠抗人pERK單克隆抗體購自Santa Cruz公司,兔抗人 M MP-9多克隆抗體購自 Sigma公司,PD98059購自碧云天公司。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗、兔抗人β-actin多克隆抗體、SP超敏免疫組化試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 免疫組織化學 按照免疫組化試劑盒說明書步驟進行pERK(1∶50)、MMP-9(1∶50)免疫組化染色,用與一抗相應的免疫前血清IgG代替一抗作為陰性對照,用已知陽性的切片作陽性對照,結果判定參考文獻[2]方法,0～1分為低表達組,≥2分為高表達組。

1.5 蛋白質印跡(Western blot)待培養的細胞至90%匯合狀態時,用4℃的 PBS沖洗細胞兩次,加入裂解液200 μL,冰上振蕩30 min,用細胞刮充分刮取細胞,離心提取上清總蛋白,按1∶4加上樣緩沖液后水煮沸3～5 min,EP管分裝凍存。不同終濃度的 PD98059(0、4、8、12 μ mol/L)處理腺癌 SPC-A-1細胞24 h后,按上述方法提取蛋白。用Bradford法測蛋白濃度。以每孔40 μ g蛋白上樣,60 V恒壓電泳,濕式電轉移入醋酯纖維膜(PVDF)。5%脫脂奶粉封閉液封閉 1 h,一抗(抗MMP-9、pERK)用抗體稀釋液(TBST)按1∶500稀釋,4℃孵育過夜,相應二抗37℃孵育1.5 h,化學發光法(ECL)檢測條帶 ,試驗重復3次。

1.6 統計學處理 采用 SAS8.2統計軟件,行χ2檢驗,當樣本量較小時采用 Fisher′s精確檢驗,Spearman相關分析,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 pERK、MMP-9在肺腺癌組織中的表達及相關性 免疫組化結果顯示,pERK蛋白主要位于癌細胞胞漿和胞核,呈棕黃色顆粒,高表達率為65.6%(44/67),正常組織高表達率為14.3%(2/14);MMP-9蛋白主要位于癌細胞細胞質,呈棕黃色顆粒,高表達率為73.1%(49/67),正常組織高表達率為21.4%(3/14)(封2圖 1)。在49例MMP-9高表達病例中pERK高表達42例(62.6%),而18例 MMP-9低表達病例中pERK高表達只有2例(4.5%),因此,pERK與MM P-9表達呈明顯正相關(r=0.57,P=0.001)。

圖2 PD98059處理 SPC-A-1細胞24 h后MMP-9蛋白表達變化

2.2 肺腺癌組織pERK、MM P-9表達與臨床病理特征的關系 統計結果顯示,pERK、MMP-9高表達率在伴淋巴結轉移的高于無淋巴結轉移患者(P＜0.05),在Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＜0.05);pERK、M MP-9表達與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關性(P＞0.05),見表1。

2.3 PD98059阻斷ERK信號通路后肺腺癌細胞MMP-9蛋白表達的變化 將不同終濃度的 PD98059(0、4、8、12 μ mol/L)處理人肺腺癌SPC-A-1細胞24 h后,Western blot檢測顯示,SPC-A-1細胞MMP-9蛋白表達水平隨著PD98059濃度升高而逐漸下降,見圖 2。

表1 pERK、MMP-9表達與肺腺癌臨床病理特征的關系

3 討 論

MMP-9是M MPs家族中相對分子質量最大的酶,主要功能是降解、破壞細胞外基質中最主要的組份Ⅳ 、Ⅴ型膠原和明膠。有研究證明MM P-9在多種癌組織中的表達明顯高于正常組織[3-5],在腫瘤侵襲和血管發生方面有重要而獨特的功能,高表達預示侵襲、轉移能力強、預后不良。但是對于其表達與信號轉導通路的關系研究很少。

ERK為MAPK家族中最重要的成員,pERK是其活化形式,可將胞外的各種刺激信號通過一系列的級聯反應傳至核內,pERK在核內促進多種轉錄因子磷酸化,增強轉錄活性,對腫瘤的發生、增殖及凋亡起調節作用[6-7],在許多人類癌癥(如口腔癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌等)中都可發現ERK表達高于正常組織,呈現過度激活。然而ERK通路是否參與了MMP-9的表達調控?它們的關系如何?Santibdfiez等[8]研究表明,ERK的激活可誘導NIH3T3細胞中尿激酶的蛋白水解活性,增加角化上皮細胞內MM P-9的分泌;Chung等[9]研究發現乳腺癌細胞及肝細胞肝癌的細胞中ERK信號途徑的活化能使MMP-9基因轉錄;Bartsch等[10]研究發現乳腺癌細胞中ERK可活化MMP-9,ERK抑制劑PD98059劑量依賴性抑制M MP-9表達,表明M MP-9可能是ERK信號途徑的下游分子。本研究結果顯示,67例肺腺癌組織中pERK和M MP-9的高表達率遠高于正常組織,且與 TNM分期及淋巴結轉移有關,提示pERK和MM P-9表達與肺腺癌的惡性進展、侵襲、轉移及預后有關。統計學分析顯示,肺腺癌組織中pERK和MM P-9表達存在正相關,表明M MP-9蛋白表達可能受ERK信號通路的調控。為了進一步研究二者之間的相互作用關系,本研究在體外研究了肺腺癌細胞中 ERK信號通路與MMP-9蛋白表達的關系。Western blot檢測顯示,PD98059以濃度依賴方式降低肺腺癌SPC-A-1細胞MMP-9蛋白表達,表明肺腺癌細胞MMP-9蛋白表達可能通過ERK信號通路來調控。

綜上所述,ERK信號通路通過上調MM P-9的表達促進肺腺癌的惡性進展及侵襲、轉移,但其確切機制有待進一步研究。本試驗結果可為ERK信號通路作為肺腺癌治療的靶點提供理論依據。

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