人TLR1胞外段的克隆及測序分析*

黃 黎,周麗珍,年四季,劉佳佳,袁 青△

(瀘州醫學院:1.基礎部;2.附屬口腔醫院,四川瀘州646000)

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)作為細胞表面模式識別受體,可識別多種病原相關分子模式(PAMPs)[1],經髓樣分化蛋白88(MyD88)依賴和非依賴的信號轉導途徑介導機體的天然免疫,同時在機體適應性免疫中也發揮重要作用[2-6]。目前,人 TLR2、TLR3、TLR4、TLR7和TLR9等受體相繼被克隆、表達,并用于對病原分子的識別機制和信號轉導機制研究。關于人T LR1的克隆和表達,國內尚未見報道。本研究擬擴增人T LR1胞外區cDNA,構建含TLR1胞外區基因的pET30a(+)-TLR1重組質粒,轉化E.coli BL21(DE3)。所獲陽性克隆子可用于T LR1的原核表達,并用于其對病原分子的識別機制及信號轉導機制研究,從而可進一步闡明TLR1相關免疫及炎癥機制,為尋找新的治療途徑與靶點提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人淋巴細胞分離液購自天津TBD公司,T RNzol Total RNA Reagent購自北京Tiangen公司;MM LV反轉錄酶購自美國Promega公司,TaKaRa LA Taq DNA聚合酶購自大連寶生物公司;膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自北京Tiangen公司;原核表達載體 pET30a(+)、E.coli BL21(DE3)由本研究室保存;T4 DNA連接酶購自Fermentas公司;其余試劑均為國產分析純;引物合成由上海博尚生物技術有限公司完成,DNA測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 人外周血單個核細胞(PBMC)分離 采取健康志愿者外周靜脈血(EDTA抗凝),按人淋巴細胞分離液試劑盒操作說明分離出PBMC,磷酸鹽緩沖液(D-Hank′s液,pH 7.4)洗滌、重懸,備提取RNA用。

1.2.2 總 RNA提取 Trizol法提取 PBMC總 RNA,具體步驟按北京Tiangen公司的T RNzol Total RNA Reagent操作說明進行。總RNA進行-70℃保存。

1.2.3 逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增目的片段 在基因庫中根據人TLR1的Gene ID(7096)查找其基因序列,結合原核表達載體 pET30a(+)上的多克隆位點采用Primer Premier5.0設計一對TLR1胞外區基因擴增引物,并在其中引入酶切位點。上游引物:5′-GTC CCATGG CTA CTA GCA

TCT TCC ATT TT-3′;下 游引物 :5′-ATA GCGGCCGCTTA GTT GCA GGA TAA TCC AGA-3′。其中上游引物5′端引入NcoⅠ酶切位點(下劃線表示),下游引物5′端引入 NotⅠ酶切位點(下劃線表示)。以提取的人PBMC總RNA為模板,按常規方法建立逆轉錄反應體系及條件合成cDNA,采用降落PCR(touchdown PCR,TD-PCR)擴增目的基因。最適反應條件:94℃預變性2 min;94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min 30 s,30個循環;72℃再延伸10 min。1%TAE瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物。

1.2.4 重組原核表達載體的構建與鑒定 用NcoⅠ和NotⅠ分別雙酶切純化回收的目的基因片段和pET30a(+)質粒,經瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收后,用T4 DNA連接酶將酶切后的目的基因和載體按摩爾比3∶1進行混合,16℃過夜連接。采用CaCl2法制備感受態 E.coli BL21(DE3),將重組體pET30a(+)-TLR1胞外區基因轉化感受態表達菌株,涂布于Amp+的LB平板上,37℃溫箱孵育16 h,挑取單個菌落于LB液體培養基中,擴大培養,做菌落PCR鑒定,對鑒定正確的質粒將其菌液送公司測序。

2 結 果

2.1 人PBMC總RNA的提取 紫外-可見分光光度計檢測分析:總 RNA 濃度=280.6 ng/μ L,OD260/OD280=2.00,說明提取的RNA濃度較高,純度好。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性:電泳結果清晰可見18 s和28 s條帶,且約為2∶1(圖1),表明 RNA無明顯降解,此RNA制劑可直接用于 RTPCR。

2.2 T LR1胞外區基因的擴增 利用提取的總RNA,應用RT-PCR技術,所獲擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,可見約1 735 bp大小片段(圖2),與預期相符。表明目的基因擴增成功。

圖1 PBMC總RNA瓊脂糖凝膠電泳

圖2 TLR1胞外區cDNA RT-PCR擴增

圖3 菌落PCR驗證轉化了的TLR1胞外區cDNA陽性克隆子

2.3 重組表達載體的構建與鑒定 由T4 DNA連接酶連接雙酶切后的目的基因和表達載體pET30a(+),轉化感受態E.coli BL21(DE3)。菌落PCR鑒定,結果表明4個克隆子擴增產物電泳后都出現了一條1 735 bp左右的片段(圖3);篩選出的陽性克隆子送上海生工測序,結果與GeneBank公布的TLR1序列一致(GeneBank登陸號:NM_003263)。證實插入序列與設計完全相符,成功構建重組表達載體T LR1胞外區基因pET30a(+)。

3 討 論

TLR1作為T LRs家族的重要成員,其在機體免疫應答當中的作用日漸引起研究者的廣泛關注。已知TLR1分布于多種免疫細胞,如單核細胞、中性粒細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等,可識別包括三酰基脂肽在內的多種菌體成分,通過TLR1/2異二聚體刺激免疫應答[7]。TLR1多態性可調節對脂肽的先天性免疫應答反應和對廣譜致病菌的臨床易感性[8]。Johnson等[9]報道TLR1單核苷酸多態性(I602S)與受體細胞表面的異常移位相關,可降低血單核細胞對細菌激動劑的應答,與麻風病的發病相關[10]。但總體來說,T LR1相關的研究還不是非常清楚和全面,對于TLR1識別微生物細胞壁成分以及細菌脂蛋白是直接的還是間接的,其識別機制怎樣,以及TLR1還可識別其他哪些PAM Ps?其結構基礎及相互作用機制如何,均有待進一步研究闡明。

本項目克隆的目的片段經表達后,可制備純化的 TLR1胞外區蛋白,為后續研究提供重要的實驗材料。(1)制備的TLR1胞外區蛋白可用于分析TLR1與病原體或其產物配體相互作用的識別機制。如研究T LR1能與哪些配體相作用,其作用方式如何,是直接作用還是間接作用等。(2)TLR1胞外區蛋白可用于后續實驗篩選制備高親和力、特異性強的人源單鏈抗體。相應的人源單鏈抗體又可用于對TLR1的阻斷效應和基因沉默研究。此外,單鏈抗體基因結構簡單,可進行基因操作,適合于細胞內表達。由此可將TLR1的人源單鏈抗體轉染細胞,作為胞內抗體,干擾TLR1的功能,研究TLR1正常表達和受干擾后的細胞生物學效應。

綜上所述,獲取純化的 TLR1胞外區蛋白后,可將其用于進一步研究T LR1對病原分子識別機制及信號轉導機制,闡明TLR1相關免疫及炎癥機制,為尋找新的治療途徑與靶點提供思路。

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