口腔癌組織中缺氧微環境對單核/巨噬細胞分泌VEGF影響的實驗研究*

馮紅超,彭江帆,馬 洪,宋宇峰

(貴陽醫學院口腔醫學系口腔頜面外科教研室,貴陽550004)

腫瘤內浸潤的單核/巨噬細胞被稱為腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAM),其功能狀態的研究對腫瘤的免疫治療具有重要的意義。由于單核/巨噬細胞不同的表型特征和活化特性與所處的局部微環境有關,而腫瘤組織內局部多處于缺氧狀態,本文通過細胞培養的方法進行研究,探討口腔癌中缺氧的微環境對單核/巨噬細胞功能影響,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司;雙抗、淋巴細胞分離液、單核細胞分離液,購于天津市灝陽生物制品科技有限責任公司;抗CD68單克隆抗體、無鈣鎂PBS液購于武漢博士德生物工程有限公司;RPMI-1640培養液購于美國Gibco公司;胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 細胞 Tca-8113人舌鱗癌細胞株,購自中國科學院細胞庫/中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心。

1.3 單核/巨噬細胞的培養及獲取 采用密度梯度離心法后通過兩次貼壁法,獲得有大量單個核細胞貼壁的培養板,然后在培養板中加入 RPMI-1640(含10%胎牛血清、1%雙抗)在37℃、5%CO2培養箱中繼續培養,每隔3 d換液,到第7天時采用機械法收獲貼壁的單核/巨噬細胞。用倒置顯微鏡觀察,可見單核/巨噬細胞貼壁細胞逐漸變大,且胞體拉長,呈梭形或多角形,具備典型的單核/巨噬細胞形態。

1.4 流式細胞儀進行鑒定 用抗CD68單克隆抗體分析懸液中的細胞,單核/巨噬細胞定義為CD68陽性細胞,結果CD68陽性細胞占94.03%,滿足實驗需要。以瑞氏染色計數單核/巨噬細胞數目,胎盤藍染色計數死細胞,中性紅計數活細胞,結果細胞活性大于96%。

1.5 細胞培養方法及檢測 將Tca-8113培養上清液(每孔0.3 mL)、巨噬細胞(每孔0.3 mL)加入12孔板中,缺氧組放入密閉的厭氧罐中(37℃、O2＜1%),常氧組在 37℃、20%O2、5%CO2條件下培養,分別在3、5、7 h收集培養上清液,后采用人VEGF ELISA試劑盒進行檢測,操作步驟嚴格按照說明書進行,每組設5個復孔。

1.6 統計學處理 應用SPSS10.0統計軟件分析,采用配對t檢驗及方差分析,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

缺氧微環境對單核/巨噬細胞分泌VEGF的影響(圖1)。在缺氧組培養5 h后,培養液中的VEGF顯著增高,7 h達到最高,在3、5、7 h,VEGF分泌量均高于同一時間內的常氧培養條件下的分泌量,差異有統計學意義(P＜0.01),這說明缺氧條件下增加了單核/巨噬細胞分泌VEGF的能力。

圖1 缺氧微環境對單核/巨噬細胞分泌VEGF的影響

3 討 論

本研究顯示,在缺氧環境下單核/巨噬細胞分泌VEGF的能力增加。

腫瘤細胞必須依賴于宿主的支持才能夠形成腫瘤,包括各種組織細胞、炎細胞、淋巴管、維持腫瘤生長和作為日后遠處轉移途徑的血管等,其共同構成了腫瘤發生、發展的微環境[1]。有研究表明,巨噬細胞是腫瘤間質中細胞數量最多的一種[2]。單核/巨噬細胞具有廣泛生物學活性和高度復雜多變的表型,在腫瘤組織中,作為正向調控的效應細胞,其介導直接的抗腫瘤細胞毒性或參與腫瘤相關抗原的提呈,以利于腫瘤的清除;另一方面,在腫瘤細胞組織內單核/巨噬細胞可分化形成具有獨特表型的巨噬細胞,這些巨噬細胞可促進腫瘤細胞的增殖及抑制T細胞和自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)的抗腫瘤活性[3-4]。單核/巨噬細胞的功能取決于所處的微環境[5],針對不同的微環境信號行使不同的功能是巨噬細胞的生物學特征。而在實體腫瘤形成過程中,腫瘤生長迅速,隨著腫瘤體積的增大,腫瘤內部不能得到足夠的血液供應,導致供氧和耗氧的不平衡,許多研究發現腫瘤內部都存在一定程度或一定區域的缺氧,缺氧是大多數實體瘤的特征之一。本課題組的前期研究顯示,在口腔鱗癌組織內有大量的巨噬細胞浸潤,進一步研究發現口腔癌組織內可以分泌對單核/巨噬細胞有趨化作用的血管細胞黏附分子-1[6],從而促使單核/巨噬細胞在口腔癌中的浸潤和聚集。近年來越來越多的證據表明腫瘤組織中的單核/巨噬細胞通過多種途徑參與了腫瘤的生長和轉移[7-8],本課題組在口腔癌的研究中發現單核/巨噬細胞可以分泌促腫瘤血管生成作用最強的因子之一VEGF[9],而VEGF在口腔癌生長和侵襲轉移中起重要作用[10]。口腔癌及其他腫瘤的研究中表明腫瘤組織中浸潤的單核/巨噬細胞多聚集在微血管較少的缺氧區域[11-12]。因此本研究推測可能由于局部缺氧的微環境是促使單核/巨噬細胞的功能發生了改變,而本研究進一步證實在局部缺氧的微環境下,單核/巨噬細胞分泌VEGF的能力增加,從而更多地參與了腫瘤的生長和轉移。

總之,本研究表明在缺氧的微環境下,單核/巨噬細胞可能通過分泌功能更多的參與了腫瘤的生長,但由于單核/巨噬細胞又具有復雜表型和活化狀態,因此其在腫瘤中的具體機制及如何調節其功能均需要進一步的研究。

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