王熙濤 何連芳 張玉蒼
隨著人民物質生活水平的提高,對動物蛋白質的需求量越來越大,因而促進了養殖業和飼料工業的迅速發展。但目前常規飼料資源的不足,必將制約畜牧業的生產發展。據各方面研究預測,我國到21世紀30年代,人口將由13億增加到16億,糧食總產量由5億噸增長到7.2億噸,其實際用于飼料量將由2.0億噸增長到3.6億噸。到2030年,按16億人口人均日消費動物性蛋白質25 g計算,屆時,全國至少約需消費1460萬噸飼用蛋白質,其中尤其是賴氨酸、蛋氨酸等限制性氨基酸缺口更大。我國飼料工業和畜牧業要走可持續、穩定、快速發展之路,必須重視非常規飼料資源的開發利用[1]。
桑樹屬桑科(Moraceae)桑屬(Morus)的落葉喬木,是多年生深根性植物。桑樹對土壤酸堿度適應性較強,在pH值4.5~9.0范圍內都能生長[2]。桑樹是目前木本葉用植物中產量最高的樹種之一,其營養成分高于一般牧草,是木本植物中含量較高的樹種。我國地域遼闊,氣候溫和,桑樹分布遍及全國,面積達到100萬公頃左右。農民向來以桑葉只是作為蠶的飼料,少數地方當有桑葉剩余時,桑葉也用來飼養家畜和塘魚。隨著畜牧業的發展,草地資源的減少,利用桑葉作為畜禽飼料已經引起畜牧業生產者的重視。桑樹葉蛋白質含量較高,氨基酸、維生素、碳水化合物、微量元素等營養成分豐富,經科學加工后是很好的全價畜禽飼料。蛋白質中賴氨酸含量是衡量產品品質優劣的重要指標。當食物中賴氨酸含量不足時,就會限制其它氨基酸的利用。研究表明在谷物糧食中加入1 g賴氨酸就相當于10 g可利用的蛋白質。桑樹葉中賴氨酸含量較高,可代替精飼料,是理想的非常規飼料[3]。
乳酸菌是一種可以分解糖類產生乳酸的革蘭氏陽性菌,厭氧或者兼性厭氧生長。不耐高溫,經80℃處理5 min,損失70%~80%。但耐酸,在pH值為3.0~4.5時仍可生長,對胃中的酸性環境有一定的耐受性。在動物體內通過生物拮抗、降低pH值、阻止和抑制致病菌的侵入和定植,降解亞硝氨、氨、吲哚、糞臭素等有害物質,維持腸道中正常的生態平衡,活菌體內和代謝產物中含有較高的SOD,能增強體液免疫和細胞免疫。研究發現,乳酸菌在魚體腸道系統定植,可以抵抗革蘭氏陰性致病菌,增強抗感染能力,增加腸系膜的免疫調節活性,促進生長。可在哺乳期和斷乳期動物中使用[4]。本試驗利用乳酸菌對桑樹葉進行發酵,通過研究原料組成、接菌量、發酵時間、發酵溫度,無機氮源等因素對乳酸菌數量的影響,得出最佳工藝條件,生產出富含較多乳酸菌利于牲畜吸收消化的非常規生物飼料。
大連工業大學資源開發利用研究所收集,產自云南自然風干的桑樹葉。
大連工業大學資源開發利用研究所實驗室保藏的乳酸菌。
餐廚廢棄物、麩皮、玉米面、豆粕、尿素,均為市售。
水分(GB/T6435—94)、粗蛋白(GB/T6432—94)、粗脂肪(GB/T6433—94)、粗纖維(GB/T6434—94)、粗灰分(GB/T6438—94)、鈣(GB/T6436—94)。
本試驗采用平板菌落計數法計算菌數含量,即通過不斷的稀釋手段使被分離的樣品分散到最低限度,然后吸取一定量注入平板,培養一段時間后,計算平板上的菌落數量[5]。
對桑樹葉主要成分進行分析,其結果如表1所示。

表1 桑樹葉主要營養成分(%)
從表1可以看出,桑樹葉營養成分豐富,粗蛋白、粗脂肪、粗纖維含量均較高,作為飼料有一定的利用價值,可與其它常規飼料混合使用。
桑樹葉發酵生產微生物飼料的主要工藝流程如圖1所示。

圖1 桑樹葉固態發酵飼料工藝流程
平板菌落計數法是微生物菌數測定常用的基本方法,具有直觀性效果。將發酵后的飼料樣品稱取1 g,攪碎,于100 ml容量瓶中定容。在無菌室中將樣品不斷稀釋至最低的濃度梯度,取0.1 ml至已冷卻的倒入了麥芽汁培養基的平皿中,用涂布器涂均勻。然后放入恒溫培養箱中培養,每隔4 h觀察,待長出菌落后計數,并做平行試驗3組,取平均值(見圖2)。

本試驗先將發酵原料與乳酸菌的初始發酵條件定為原料配比3:1、接菌量6%、發酵時間60 h、無機氮源添加量1.5%、發酵溫度34℃、pH值6,含水量80%。然后對每個因素單獨進行考察,進而確定單因素的最佳發酵條件。
3.4.1 發酵原料配比對乳酸菌生長數量的影響
選取常規飼料玉米面、豆粕、麩皮(比例為3:1.5:1)與粉碎過篩的桑樹葉混合,在初始條件下進行發酵,改變常規飼料與桑樹葉的比例,其配比對乳酸菌生長數量的影響如圖3所示,當常規飼料與桑樹葉比例為4:1時,乳酸菌的生長數量達到最大值,是發酵原料的最佳配比。

圖3 發酵原料配比對乳酸菌生長數量的影響
3.4.2 接菌量對乳酸菌生長數量的影響
接菌量對菌數影響如圖4所示。隨接菌量的增多,發酵后乳酸菌數量也逐漸升高,但是當接菌量高于8%時,發酵后菌數反而降低,因此接菌量在8%時最為適宜。

圖4 接菌量對乳酸菌生長數量的影響
3.4.3 發酵時間對乳酸菌生長數量的影響
發酵時間對菌數影響如圖5所示。菌種在60 h之前生長迅速,在60 h時達到最大值,之后數量逐漸遞減,84 h之后數量變化趨于平穩。

圖5 發酵時間對乳酸菌生長數量的影響
3.4.4 無機氮源添加量對乳酸菌生長數量的影響
無機氮源對菌數影響如圖6所示。本試驗選取添加尿素作為無機氮源,從圖6可以看出,開始隨著尿素的增加,菌數也逐漸升高,在尿素添加量為2.0%時,菌數達到最大值,之后隨著尿素的進一步增加,菌數又逐漸降低,說明過量的無機氮源抑制了菌種的生長。
3.4.5 發酵溫度對乳酸菌生長數量的影響

圖6 無機氮源添加量對乳酸菌生長數量的影響
發酵溫度對乳酸菌生長數量影響如圖7所示,由圖7可知菌種生長的最適溫度是36℃。
3.4.6 pH值對乳酸菌生長數量的影響
發酵原料的pH值對菌數影響如圖8所示,由圖8可知菌種生長的最適pH值為5.5。
3.4.7 含水量對乳酸菌生長數量的影響

圖7 發酵溫度對乳酸菌生長數量的影響

圖8 pH值對乳酸菌生長數量的影響

圖9 含水量對乳酸菌生長數量的影響
原料中含水量對菌數影響如圖9所示。發酵時含水量在85%~100%變化時,對菌數影響相對較小,特別是在含水量大于90%之后,菌數無明顯變化,因此以含水量在90%時為宜。
為進一步優化發酵條件,在單因素基礎上,選取發酵時間、發酵溫度、接菌量、尿素添加量4個因素做4因素3水平(L934)正交試驗,結果見表2。

表2 正交試驗結果
根據計算各列極差R可知,影響發酵條件的主要因素為接菌量,其次是尿素添加量、發酵時間和發酵溫度。最佳發酵條件為:接菌量9%,發酵時間60 h,尿素添加量2.0%,發酵溫度36℃。經凱氏定氮法測定,此工藝條件下微生物飼料粗蛋白含量為29.56%,
①桑樹葉營養成分豐富,蛋白質含量較高,特別是含有必需氨基酸——賴氨酸,可取代部分常規飼料與乳酸菌一起發酵制備微生物飼料。
②在單因素試驗基礎上進行正交試驗,得出發酵的最佳工藝條件為:接菌量9%,發酵時間60 h,尿素添加量2.0%,發酵溫度36℃。
[1]吳萍,李龍.桑樹用作畜禽飼料的開發前景 [J].中國蠶業,2006,27:91-93.
[2]葉志毅,劉紅.利用桑樹葉資源發展畜牧業生產的可行性分析[J].中國畜牧雜志,2003,39(1):43-44.
[3]李勇,苗敬芝.桑葉的功能性成分及保健制品的開發[J].中國食物與營養,1999(3):25.
[4]李維炯.微生態制劑的應用研究[M].北京:化學工業出版社,2008:65-70.
[5]劉國生.微生物學實驗技術[M].北京:科學出版社,2007:125-127.