豬小腸粘膜上皮細胞的分離及體外原代培養模型的建立

職愛民 左建軍 黃志毅 鄒仕庚 馮定遠

腸粘膜上皮細胞(Intestinal epithelial cells,IEC)是腸道的重要功能細胞，參與腸道食糜的消化、吸收、免疫屏障和應激反應等，并與腸道的內、外分泌功能關系十分密切。長期以來，在研究IEC的生物學功能、細胞增殖和分化的調控因素，物質吸收與代謝等多采用腸道腫瘤細胞系為試驗模型[1]。然而癌細胞是非正常的細胞，其生理特征明顯不同于正常細胞，單純由癌細胞系的研究結果來解釋正常細胞的行為，明顯有其不足。原代培養是從供體取得組織細胞后在體外進行的首次培養，原代培養的細胞生物學特性變化較少，最能反映和接近體內生長特性，是一種良好的試驗載體。國外早在1993年就有豬腸細胞原代培養的報道[2]，其它類型的豬組織細胞原代培養的報道也不少[3-5]，國內關于動物體細胞原代培養的報道多集中在其它動物身上[6-9]，而關于豬IEC原代培養的方法一直屬于空白。本試驗的目的就是通過機械和酶消化結合的方法建立豬IEC原代培養的系統，為豬腸道營養的研究提供新的試驗材料。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

新生杜×長×大三元雜交仔豬（未吮奶），購于廣東省原種豬場。

1.2 主要儀器設備與試劑

NU-2500型CO2細胞培養箱(Nuaire公司，美國)；IX70型倒置生物顯微鏡(Olympus公司，日本)；5804R型高速大容量冷凍離心機(Eppendorf公司,德國)；SWCJ-1F型超凈工作臺(蘇州凈化，中國)；HVE-50型高壓蒸汽滅菌鍋(HIRAYAMA公司，日本)；GF-M2000型酶標儀（山東高密彩虹儀器公司）；CS101-2AB型鼓風干燥箱(重慶試驗設備廠)；79-1型磁力加熱攪拌器(江蘇金壇榮華儀器總廠)；Orion420A+型酸度計(Thermo Electron公司，美國)；DMEM培養基、胎牛血清、胰酶和膠原酶Ⅱ型(Gibico公司)，標準胎牛血清（杭州四季青公司），青霉素、鏈霉素、β-甘油磷酸鈉、硝酸鈷、硫化銨(Sigma 公司)，NaCl、KCl、NaH2PO4·12H2O，K2HPO4、丙酮、硝酸鈣、硫酸鎂等試劑均為國產、分析純。

2 試驗方法

2.1 豬IEC的分離培養

2.1.1 主要試劑配制

按照說明書配制DMEM-F12不完全培養基，0.22 μm過濾除菌，分裝，4℃避光保存備用。1 gⅡ型膠原酶干粉溶于100 ml上述配好的DMEM-F12不完全培養液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，1.5 ml Eppendorf管以1 ml/管分裝，-20℃保存備用。DMEM-F12完全培養基為DMEM-F12不完全培養基加10%的胎牛血清。

2.1.2 豬IEC的分離

參照文獻報道的方法[10－11]并根據實際情況調整,具體如下:將剛出生未吮乳的仔豬頸動脈放血處死,75%的酒精擦洗消毒后，置于超凈工作臺。無菌條件下打開腹腔,整體分離腸道,迅速投入盛有15 ml 37℃預熱DMEM-F12不完全培養基的平皿中；分別取十二指腸、回腸和空場各15 cm左右，沿縱向剪開，培養基沖洗三遍并用玻片輕輕刮去表面雜物；清洗后的培養基轉移到新的盛有15 ml 37℃預熱DMEM-F12不完全培養基的平皿中，取出小腸，DMEM-F12培養基分離IEC細胞，用玻片輕輕分離腸粘膜組織；用移液器吹打均勻后轉移到細胞培養瓶中，加入Ⅱ型膠原酶至0.1%終濃度；分別置4℃和37℃各消化12 h和2 h后加等量的DMEM-F12完全培養基終止消化，1000 r/min離心10 min后移去上清并用DMEM-F12完全培養基懸浮，重復一次后完全培養基懸浮并計數，按（1～5）×105密度接種，37 ℃、5%CO2培養。

2.2 豬IEC的傳代培養

移除培養液，PBS沖洗細胞兩次，然后加入0.25%的胰酶，鏡下觀察大部分細胞回縮呈橢圓形時小心移除消化液，加入完全培養液吹打細胞懸液，使其均勻，調整所需細胞密度，接種后置于37℃、5%CO2培養。

2.3 MTT法測定豬IEC的增殖

四甲基偶氮唑藍(MTT)母液(5 mg/ml)：稱取250 mg MTT，溶于50 ml PBS中，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,分裝后-20℃避光保存備用。

參照Sladowski的方法并做改進[12]，具體如下：將細胞懸液稀釋為5×104個/ml，接種于96孔細胞培養板內，每孔 200 μl。共接 10板。分別于接種后 24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h 取一板細胞，吸去培養液，在每孔中加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，入培養箱繼續培養6 h，取出棄上清液，用PBS清洗一遍后每孔中加入200 μl DMSO，室溫下放置30 min，用酶標儀讀取490 nm處吸光值(OD490)。

2.4 豬IEC的鑒定

2.4.1 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）的鑒定

取生長良好的細胞，吸去培養液，用PBS洗細胞3次；80%冷丙酮固定10 min，吸棄，PBS洗3次；加入酶反應基質液 （2%巴比妥鈉1 ml、3%β-甘油磷酸鈉1 ml、2%硝酸鈣 2 ml、2%硫酸鎂 1 ml、蒸餾水 5 ml,pH=9.2～9.4）37℃反應2 h,吸棄，PBS洗3次；加入2%硝酸鈣2 min,吸棄，PBS洗3次；加入2%硝酸鈷2 min后吸棄;加入2%硫化銨，放入37℃培養箱10 min，吸棄；流水沖洗，鏡檢。

2.4.2 免疫學方法鑒定

在96孔板中接種密度為1×105個/ml的細胞懸液，每孔100 μl，接種4 d后進行IEC角蛋白8的免疫酶聯反應，以肌細胞作為陰性對照。具體操作步驟如下：80%冷丙酮固定10 min,吸干多余的冷丙酮；用PBS 洗細胞 2 min×3 次；吸去多余的 PBST,加 50 μl封閉液于孔中,37℃孵育10 min；吸干液體,并用PBST洗2 min×3次；每孔細胞加 100 μl的一抗（鼠抗人角蛋白 8單抗）,37℃溫育 30 min；PBST洗 2 min×3次;每孔加50 μl抗小鼠生物素二抗,37℃孵育20 min;PBS洗2 min×3次；每孔加50 μl HRP標記鏈親和素，37℃孵育 20 min；PBS洗 2 min×3次現用現配 DAB顯色液 （DAB底物緩沖液：DAB顯色液： 底物溶液： 三蒸水=1：1： 1： 20）；每孔加 50 μl DAB 顯色液，室溫顯色2～5 min；自來水沖洗，鏡檢。

3 結果

3.1 豬IEC的分離培養

無菌分離后小腸，可以觀察到懸浮于培養基的絨毛，鏡下清晰可見(圖1a)。消化接種后24～48 h內貼壁(圖1b)，貼壁的IEC呈單層生長，形狀不一，大多呈多角形，細胞表面有多個突出，胞漿飽滿，核為圓形或卵圓形，核仁1～2個，符合小腸上皮細胞的特征。貼壁的IEC呈單層生長，形狀呈三角形或者多角形和梭形等，細胞生長良好，5～6 d形成細胞群落，9～11 d匯合成片(圖1c)，細胞排列緊密，互相簇擁而形成“鋪路石樣”(圖1d)。

圖1 豬腸上皮細胞的分離、培養

3.2 體外原代培養豬IEC的增殖

其生長曲線如圖2所示。由圖2可知，接種后48 h細胞處于適應休眠期，然后開始進入對數生長期，在216 h后處于停滯期，細胞不再增殖。群體倍增時間約為72 h。

圖2 豬IEC的生長曲線

3.3 豬IEC的鑒定

3.3.1 堿性磷酸酶的鑒定

堿性磷酸酶顯色后，可以看到細胞胞質含黑色顆粒，細胞骨架清晰；90%以上的細胞呈陽性反應，如圖3所示。

圖3 堿性磷酸酶鑒定IEC

3.3.2 免疫學方法鑒定

免疫學方法鑒定上皮細胞角蛋白8的表達，陽性細胞呈棕黃色或棕褐色，90%以上的細胞呈陽性反應，如圖4所示。

圖4 免疫學方法鑒定IEC（100×）

4 討論

位于消化管內壁的腸上皮是一種單層組織，由腸隱窩基部的干細胞不斷增殖。上皮細胞和成纖維細胞之間有緊密的聯系，共同被稱作內胚層結構增殖單位。完整的內胚層結構增殖單位可以很好地通過細胞與細胞、細胞與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)之間的相互作用或者信息分子的復雜信號網絡來維持自身的平衡[13]。但這個平衡系統在離體組織樣品中是很脆弱的，因組織突然供血不良、溫度調節失衡、細胞和細胞、細胞和ECM的相互作用也會紊亂。上皮細胞和ECM聯系的紊亂會導致細胞程序化的死亡，即失巢凋亡現象(anoikis)[14]。腸干細胞對失巢凋亡有高度的敏感性，這也正是腸上皮細胞原代培養很難獲得成功的主要原因。常用的分離方法包括組織切塊移植法、機械分離法、螯合作用和酶消化法，酶消化法分離上皮細胞的優勢可以消除一些細胞和細胞之間的相互作用,尤其是上皮細胞和隱窩成纖維細胞之間的相互作用。所有酶中膠原酶因其對上皮細胞的損傷較小而使用得最多。本研究使用膠原酶分離IEC，效果良好。

細胞培養成敗的一個重要因素就是防止污染，從試驗材料到試驗場地、用具、操作和培養保持，任何一個環節的不注意，都可能造成試驗的失敗。本試驗選取新生的、未進食的仔豬，其腸腔內屬于相對無菌環境，避免了主要的污染來源。適時傳代對于培養細胞的正常生長具有重要意義。要注意觀測細胞的狀態，觀察是否有調亡的現象發生，正常細胞鋪滿80%就可以考慮傳代。傳代過晚會影響細胞的生長甚至引起凋亡。消化時注意消化時間和消化液用量的控制，消化液以剛好覆蓋瓶（孔）底為宜，鏡下觀測控制消化時間，最佳終止時間在60%～80%細胞收縮成圓形時。在消化細胞前將胰酶在37℃水浴中溫熱10 min左右，可以達到最好的消化效果，而且節省操作時間，消化后細胞很容易吹打成為單個細胞，因為容易吹打，所以對細胞的損傷小。

AKP是一種磷酸單酯鍵水解酶，在堿性條件下活性最強，可以水解磷酸化的糖、核酸和蛋白上的磷酸基團。小腸堿性磷酸酶是小腸分化與成熟的一類標志性酶，參與小腸的物質代謝，因此可作為IEC鑒定的標志[15]。本試驗中，堿性磷酸酶鑒定呈陽性，從生化的角度證明所獲得的細胞是IEC。細胞角蛋白為上皮組織的特征性抗原成分[16]，本試驗選用生物素標記的細胞角蛋白抗體通過免疫學試驗來鑒定豬IEC。試驗結果顯示小腸上皮細胞為陽性(棕色)，陰性對照不顯色，從細胞生物學角度鑒定了所培養的細胞為IEC。綜上所述，本試驗通過機械分離和膠原酶消化相結合的方法，成功地在體外培養了新生仔豬IEC，為豬腸道營養建立了理想的試驗模型。

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