嬰幼兒腹瀉病杯狀病毒感染分析

胡記妹，黃綽妤，曾軍榮，楊懷秀

（廣東省廣州市從化市中心醫院檢驗科，廣東廣州 510900）

己有研究證明我國嬰幼兒中存在諾瓦克樣病毒 （Nomvalk-like virus，NLV）和札幌樣病毒（Sapporo-like virus， SLV）兩種人類杯狀病毒（human calicivirus，HuCV）的感染，近年來我國杯狀病毒性腹瀉發生率呈上升趨勢，己在多個地區發生暴發流行[1]；由于不能早期干預，一些嬰幼兒由杯狀病毒感染引起損害及危及生命，給家庭及社會帶來巨大損失。從化地區是廣州的縣級城市，50多萬人口，周邊地區有眾多民工，人口聚集，極易暴發流行各病毒感染。2005年1月～2007年12月筆者在從化地區用RT-PCR方法檢測了非細菌性腹瀉病患兒糞便標本的杯狀病毒，分析從化地區嬰幼兒杯狀病毒性胃腸炎的流行情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2005年1月～2007年12月，我院門診與住院診治的6 678名0～7歲就診腹瀉患兒，男3 361名，女3 317名。

1.2 標本采集

2005年1月～2007年12月在廣東省廣州市從化巿中心醫院住院部和門診部兒科采集嬰幼兒非菌性腹瀉糞便標本。

1.3 檢測前準備工作

糞便標本處理：加入1 ml樣品稀釋液（sample diluent）至1.5 ml EP管中，加入0.1 g固體糞便標本或0.1 ml液體糞便標本，置于漩渦震蕩器混勻，室溫靜置10 min，室溫下≥5 000 r/min離心5 min，備用。

1.4 病毒RNA提取

1.4.1 提取前的準備工作 ①將1 ml Buffer AVL加入裝有低壓凍干的Carrier RNA中，徹底溶解Carrier RNA后，將溶有Carrier RNA的Buffer AVL轉入至Buffer AVL瓶中，徹底混勻。分裝貯存于2～8℃。如果在2～8℃時，Buffer AVL/Carrier RNA溶液形成沉淀，可在80℃重新溶解，注意加熱的時間不能超過5 min，用前冷卻至室溫。Buffer AVL/Carrier RNA溶液不能加熱超過6次。②加入合適比例的96%～100%的酒精至Buffer AW1中，19 ml的Buffer AW1加入酒精25 ml。③加入合適比例的96%～100%的酒精至Buffer AW2中，13 ml的Buffer AW2加入酒精30 ml。

1.4.2 病毒RNA的提取 ①在1.5 ml EP管中加入560μl已加入Carrier RNA的Buffer AVL。②將140μl 10%便懸液加入至EP管中的Buffer AVL中，vortex混勻15 sec。③室溫（15～25℃）孵育10 min。④將1.5 ml EP管輕微離心，以去除管內的液滴。⑤在管內加入560μl 96%～100%的酒精，vortex混勻15 sec。混勻后，將1.5 ml EP管輕微離心，以去除管內的液滴。⑥小心地將630μl步驟⑤中的溶液加入至已放入2 ml收集管中的QIAamp離心柱中，注意不要弄濕柱子邊緣。蓋上蓋子，8 000 r/min離心1 min。將QIAamp離心柱放置至另一干凈的2 ml收集管中，棄去包含有濾過液的收集管。⑦小心打開QIAamp離心柱的蓋子，重復步驟⑥。⑧小心打開QIAamp離心柱的蓋子，加入500μl Buffer AW1。蓋上蓋子，8 000 r/min離心1 min。將QIAamp離心柱放置至另一干凈的2 ml收集管中，棄去包含有濾過液的收集管。⑨小心打開 QIAamp離心柱的蓋子，加入 500μl Buffer AW2。蓋上蓋子，14 000 r/min離心3 min。棄去收集管中的濾過液，14 000 r/min離心空柱子1 min。⑩將QIAamp離心柱放置入干凈的1.5 ml離心管中。棄去包含有濾過液的收集管。小心打開QIAamp離心柱的蓋子，加入60μl Buffer AVE至離心柱中，蓋上蓋子，室溫孵育1 min。8 000 r/min離心1 min。（2×40μl的Buffer AVE洗脫 2次，能增加產量。）病毒 RNA進行反轉錄，或貯存于-20℃或-70℃備用，所用引物序列參見文獻[2]。

2 結果

2.1 HuCV感染情況分布

6 678名0～7歲腹瀉患兒中898例大便檢測出HuCV，檢出率為13.45%，見表1。

表1 2005年1月～2007年12月小兒腹瀉HuCV感染情況分布（例）

2.2 不同性別、年齡與HuCV感染的關系

在3 361例男性腹瀉患兒中有455例HuCV陽性，占13.54%，3 317名女性腹瀉患兒中有443例HuCV陽性，占13.36%，各年齡組患兒的大便均檢測出HuCV，以6個月～3歲年齡組分布較多，見表2。

表2 小兒腹瀉HuCV感染年齡及性別分布情況

3 討論

近年來隨著分子生物學技術的發展，病原檢測手段不斷提高，國外文獻對人類杯狀病毒與疾病的關系已有較全面的研究報道，目前認為是除輪狀病毒外造成腹瀉的最重要的病毒病原；在我國對輪狀病毒感染的研究較多，輪狀病毒感染是嬰幼兒非細菌性腹瀉的主要病原，發展中國家每年有60萬～70萬名兒童死于重型輪狀病毒腹瀉[3-6]。本資料結果顯示：0～7歲腹瀉患兒的大便HuCV陽性率為13.45%；與文獻報道相一致[7]。HuCV流行的一般特點：HuCV存在多種傳播途徑，即人-人傳播、食物傳播、水源傳播，其中人-人傳播又可分為糞-口傳播和嘔吐物的氣溶膠傳播[8]。由于HuCV感染劑量低（＜100病毒顆粒）、缺乏持續的免疫力且人群對HuCV普遍易感、存在多種潛在傳播途徑等，導致HuCV感染極易形成暴發。

HuCV感染在10～12月期間發生率較高，達694例，占77.28%以上，與其他時間段差異顯著。HuCV感染在6個月～3歲為高峰期，與其他組比較差異顯著。可能與嬰幼兒期的喂養方式有關：6個月以內的嬰兒多為母乳喂養，母乳中存在HuCV抗體、胰蛋白酶抑制劑、非免疫球蛋白性病毒抑制劑[9]，不易感染HuCV，且母乳喂養兒腸道中存在著一定數量的細菌群，主要是雙歧桿菌，腸道正常菌群的存在能抑制HuCV的感染；另外嬰幼兒期體內來自母體的獲得性抗體在6個月以后漸漸消失，而自身的免疫系統尚未建立，機體對HuCV抵抗力減弱有關，所以發生率較高。6歲以后，隨著自身的免疫系統的建立，機體對HuCV抵抗力增強，發生率顯著降低。

HuCV腹瀉患兒的臨床資料分析表明，HuCV感染的臨床癥狀與輪狀病毒相似，以腹瀉為主，約半數患兒伴有嘔吐，并有不同程度的發熱和腹痛等癥狀，部分患兒存在輕度到中度脫水，未發現嚴重脫水，均未見抽搐、休克等嚴重并發癥。檢測結果也表明廣州地區嬰幼兒腹瀉病主要是杯狀病毒，杯狀病毒已成為繼輪狀病毒之后嬰幼兒腹瀉的重要病原體，分型引物RT-PCR法能夠快速進行杯狀病毒分組和鑒定，廣泛適用于杯狀病毒分子流行病學研究，為更好地預防和控制杯狀病毒腹瀉提供依據。

[1]陳冬梅,張又,錢淵,等.我國嬰幼兒中存在不同基因型杯狀病毒的感染[J].病毒學報,2001,17(3):265-269.

[2]Jiang X,Huang PW,Zhong WM,et al.Design and evaluation of a primer pair that detects both Norwalk and Sapporo-like caliciviruses by RT-PCR[J].JVirol Method,1999,83(3):145-154.

[3]Class RI,Bresee JS,Turclos R,et al.Rotavirus vaccines:targeting the developing world[J].JInfect Dis,2005,192(Suppl 1):S160-166.

[4]Kapikian AZ,Hoshino Y,Chanock RM,et al.Fieldsvirology[M].4th ed.Philadelphia:Lippincott-Paven,2001:1783-1833.

[5]Widdowson MA,Bresee JS,Gentsch JR,et al.Rotavirus disease and its prevention[J].Curr Opin Gastroentero,2005,21(1):26-31.

[6]曲梅,楊文,董建紅.秋冬季嬰幼兒腹瀉206例臨床分析[J].齊魯醫學雜志,2004,19(4):347-348.

[7]Ksnipe DM,Howley PM.Fields Virology[M].4th ed.Philadelphia:Lippincott-Raven Publishers,2001:841-874.

[8]焦富勇,康華,王可勝,等.小兒輪狀病毒感染性腹瀉研究進展[J].國外醫學:婦幼分冊,2002,13(1):42-44.

[9]張麗杰,杜曾,章青,等.昆明市兒童醫院1998～2001年輪狀病毒哨點檢測分析[J].中華流行病學雜志,2004,25(5):396-399.