2，3-丁二醇發酵過程的菌體生物質回收利用初步研究

目前，國內外生物行業發展迅速。在微生物發酵過程中，發酵末期的菌體往往不是目的產物，因此會產生大量的廢菌體。一般的處理方法是將廢菌體在污水處理廠中分解，或是燃燒處理，這不僅污染環境、破壞生態,也造成了嚴重的資源和能源浪費[1～5]。若能循環利用廢菌體，不僅可以節能減排，還可節約資源，對于建設科技含量高、資源消耗少、環境污染小的新型產業具有重大而深遠的意義。

2，3-丁二醇(BD)是一種很有潛力的替代能源，燃燒值為27 200 kJ·kg-1，可進一步制得多種用途廣泛的衍生物，如甲乙酮、1，3-丁二烯[6]、辛烷[7]等。在脫氫酶的作用下，2，3-丁二醇可以氧化生成3-羥基-2-丁酮(乙偶姻，AC)，AC是一種應用廣泛、令人喜愛的食用香料[8,9]。國內市場近幾年對2，3-丁二醇的需求逐年上升。

作者嘗試將粘質沙雷氏菌利用蔗糖生產2，3-丁二醇發酵過程中的廢菌體回收處理，研究并優化回收廢菌體作為發酵培養基成分的方法。將廢菌體進行離心、懸浮、高壓均質、再離心等處理后，制備成溶菌液，作為發酵培養基中的氮源。對酵母粉和溶菌液分別作為氮源的發酵效果進行了比較，對多次回收廢菌體制備的溶菌液作為發酵培養基中的氮源進行了研究，并將溶菌液作為氮源的發酵條件在3.7 L發酵罐上進行放大驗證實驗。

1 實驗

1.1 溶菌液的制備

發酵末期的發酵液，用冷凍離心機于7000 r· min-1離心60 min，得到菌體沉淀，-20℃下冷凍保藏待用[10]。

融化冷凍的菌體，按菌體沉淀與去離子水質量比約為1∶4的比例，將菌體沉淀懸浮于去離子水中，得到懸浮菌液。在冷凍-融化的過程中，部分菌體發生了破碎。懸浮菌液在高壓均質機的作用下進行細胞破碎，壓力為80 MPa，循環破碎3次，溫度保持在30℃以下。均質后的液體，先用冷凍離心機于7000 r· min-1離心60 min，將較大顆粒沉淀去除，再用冷凍離心機于10 000 r· min-1離心30 min，去除沉淀，得到的上清液即為溶菌液。溶菌液在-20℃下冷凍保藏待用。

以酵母粉為氮源進行發酵，所得廢菌體制備成的溶菌液為Lysate 1；以Lysate 1為氮源進行發酵，所得廢菌體制備成的溶菌液為Lysate 2。

1.2 菌種和培養基

粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，自行保藏，保存于斜面培養基中。

斜面培養基(g·L-1)：葡萄糖 20，酵母粉 10，蛋白胨 10，瓊脂粉 20，以NaOH調pH值7.0～7.2，115℃滅菌20 min。

種子培養基(g·L-1)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，(NH4)2SO46，K2HPO410，NaCl 0.5，MgSO40.5，接種前以NaOH調pH值7.0～7.2，115℃滅菌20 min。

基礎發酵培養基(g·L-1) ：蔗糖90，酵母粉25，檸檬酸三鈉14，MnSO40.05，NH4H2PO43，FeSO40.02，MgSO40.5，以NaOH調pH值7.0～7.2，115℃滅菌20 min。

優化發酵培養基Ⅰ:以含氮量相當于25 g·L-1酵母粉的Lysate 1代替基礎發酵培養基中的酵母粉作為氮源。

優化發酵培養基Ⅱ:以含氮量相當于25 g·L-1酵母粉的Lysate 2代替基礎發酵培養基中的酵母粉作為氮源。

1.3 儀器

KLF2000型3.7 L比歐發酵罐；Beckman J-26XP型離心機、J2-HS型離心機；AH110B型高壓均質機；UV-2008H型分光光度計；Aglient GC 9860型氣相色譜議；Vario EL Ⅲ型元素分析儀。

1.4 培養方法

1.4.1 菌種活化

取保藏菌種，劃線接種于斜面培養基中，30℃ 恒溫培養約24 h。

1.4.2 種子培養

在250 mL搖瓶中裝入30 mL種子培養基，接兩環保存在斜面培養基上的種子至種子培養基中，于30℃、200 r· min-1下搖床培養11～12 h。

1.4.3 搖瓶發酵培養

Yeast extract組和Lysate組分別利用基礎發酵培養基和優化發酵培養基Ⅰ。按5%(體積分數)的接種量轉接種子液至裝有50 mL發酵培養基的250 mL搖瓶中，于30℃、200 r· min-1下搖床培養，蔗糖消耗完，發酵結束。

1.4.4 以多次回收廢菌體制備的溶菌液作為氮源的搖瓶發酵培養

Yeast extract組、Lysate 1組和Lysate 2組分別利用基礎發酵培養基、優化發酵培養基Ⅰ和優化發酵培養基Ⅱ。按5%(體積分數)的接種量轉接種子液至裝有50 mL發酵培養基的250 mL搖瓶中，于30℃、200 r· min-1下搖床培養，蔗糖消耗完，發酵結束。

1.4.5 連續補料發酵培養

利用優化發酵培養基Ⅰ。取100 mL種子液接種于3.7 L比歐發酵罐，起始裝液量為1.8 L，起始攪拌轉速為300 r· min-1，通氣量為1 vvm，發酵溫度為30℃。初始蔗糖濃度為90 g·L-1，當殘留蔗糖(Residual sucrose)濃度小于10 g·L-1時，采用流加式連續補料，補入濃度為80%的蔗糖水溶液，使發酵罐中殘留蔗糖濃度保持在10～30 g·L-1。培養41～45 h，發酵結束。根據實驗要求，通過調節攪拌轉速來實現發酵液中的不同溶氧水平。

1.5 測定方法

1.5.1 菌體濃度測定

采用分光光度計在波長600 nm下測定吸光度(OD)，細胞干重(DCW，g·L-1)由標準曲線(DCW=0.422×OD-0.0363)換算獲得。

1.5.2 發酵液中殘留蔗糖濃度的測定

樣品經離心，取上清液用2 mol·L-1H2SO4水解，再用4 mol·L-1NaOH中和，用葡萄糖液體試劑盒(上海捷門生物技術公司)測出葡萄糖濃度，再換算成殘留蔗糖濃度。

1.5.3 產物測定

發酵液離心后用乙酸乙酯萃取，通過氣相色譜儀來測定AC和BD的濃度。

色譜柱采用毛細管柱DB-5，并采用FID氫火焰檢測器，氮氣作為載氣，流速為1 mL· min-1，柱溫為50℃，保留1.5 min，25℃· min-1升溫到180℃，保留10 min，進樣口溫度為215℃，檢測器溫度為245℃。

1.5.4 酵母粉和溶菌液中含氮量和含碳量的測定

用真空冷凍干燥機將溶菌液冷凍干燥制成粉末；用元素分析儀測定酵母粉和溶菌液粉末中碳、氮、氫元素的含量[11]。根據酵母粉和溶菌液的含氮量，確定發酵培養基中添加溶菌液的量。

2 結果與討論

2.1 酵母粉和溶菌液的含氮量

酵母粉和溶菌液粉末中碳、氮、氫元素的含量如表1所示。

表1 酵母粉和溶菌液中N、C、H元素的含量

由表1可知，Lysate 1比安琪酵母粉的含氮量低，Lysate 2比Lysate 1的含氮量低。這可能是因為，利用溶菌液作為氮源進行發酵，由于缺少某些金屬離子，菌體衰亡比較快，菌體碎片和靈菌紅素等物質較多，因此，經高壓均質等工藝制備成的溶菌液含氮量較低。

2.2 搖瓶發酵培養

圖1 酵母粉和溶菌液作為氮源的比較

由圖1可知，從菌體生長情況看，溶菌液作為氮源比酵母粉作為氮源的最大細胞干重要大，達7.5 g·L-1，說明利用溶菌液作為氮源對于菌體生長沒有不利的影響；18 h發酵結束時，酵母粉作為氮源的殘留蔗糖濃度為0.5 g·L-1，而溶菌液作為氮源的殘留蔗糖濃度為9.04 g·L-1，此時，兩者的BD濃度分別為41.6 g·L-1和39.3 g·L-1，產物濃度相當。由此可知，用溶菌液代替酵母粉作為氮源進行發酵具有可行性。

2.3 多次回收溶菌液作為氮源實驗(圖2)

圖2 多次回收廢菌體制成溶菌液的分批實驗

由圖2可知，與利用酵母粉和Lysate 1相比，利用Lysate 2的菌體生長情況相差不大，最大細胞干重為7.65～7.83 g·L-1；但是利用Lysate 2的BD濃度略低于利用酵母粉和Lysate 1，酵母粉和Lysate 1作為氮源發酵末期的BD濃度分別為41.6 g·L-1和43.7 g·L-1，而Lysate 2作為氮源發酵末期的BD濃度為38.2 g·L-1。雖然利用Lysate 2作為氮源發酵末期的BD濃度偏低，但是AC和BD的總濃度與利用酵母粉的相當，分別為45.28 g·L-1和45.08 g·L-1。利用Lysate 2部分取代氮源對于節能減排具有積極的意義，可以通過優化，在發酵培養基中添加一些元素，彌補Lysate 2中不足的成分，提高合成BD的濃度。

2.4 連續補料發酵培養(圖3)

圖3 溶菌液作為氮源的3.7 L發酵罐實驗

連續補料發酵培養，42 h 結束時，BD濃度為109.2 g·L-1，殘留蔗糖濃度為5.2 g·L-1，共有221.95 g·L-1蔗糖被消耗，2，3-丁二醇轉化率達到0.492 g·g-1，產率達到2.6 g·L-1·h-1。2，3-丁二醇發酵屬于微耗氧發酵，對氧的要求非常嚴格，其途徑是一種混合酸途徑，形成的有機酸包括乙酸、乳酸和丁二酸等[12]。由圖3可以看出，發酵后期，菌體濃度下降趨勢較快，這可能是發酵后期有機酸等副產物積累過多所致。

2.5 討論

本研究中，溶菌液是回收發酵末期粘質沙雷氏菌廢菌體制備而成，溶菌液含有可供菌體生長和產物合成的某些營養物質，特別是各種氨基酸類物質[13]，可替代酵母粉，作為發酵培養基中的氮源。另外，溶菌液具有制備工藝簡單的特點。因此，不但可以一定程度上減少發酵過程中廢菌體的排放，還可以減少對部分原料的需求。

3 結論

將粘質沙雷氏菌利用蔗糖生產2，3-丁二醇發酵末期的廢菌體回收利用，制備成溶菌液，替代發酵過程中的氮源。搖瓶發酵培養中，2，3-丁二醇濃度為 39.3 g·L-1，與酵母粉作為氮源相比，產物濃度相當。多次回收廢菌體制成溶菌液替代酵母粉作為氮源，2，3-丁二醇濃度略低。連續補料發酵培養中，共有221.95 g·L-1蔗糖被利用，2，3-丁二醇最高濃度為109.2 g·L-1，2，3-丁二醇轉化率達到0.492 g·g-1、產率達到2.6 g·L-1·h-1。由此表明，回收廢菌體基本具有節能減排的可行性。

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